中国东海微型鞭毛虫群落的分布特征及其环境影响因子

　　摘要：海洋微型鞭毛虫 (Microbial flagellates) 是海洋原生生物中一类高度异质化的类群，物种多样性高，具有多种营养方式，在全球海洋生态系统中占据广阔的生态位，在生物地球化学循环中发挥着关键作用。 然而关于其生物多样性和群落结构的认识十分有限，特别是有关环境因子与其生物地理分布关系的研究更为罕见。 为了探究微型鞭毛虫群落多样性、群落结构以及影响其生物地理分布格局的环境因素，本研究将高通量测序技术与传统的显微镜观测方法相结合，全面调查了中国东海春季和秋季微型鞭毛虫的群落特征，并深入探讨了与环境因子之间的关系。 结果表明：东海微型鞭毛虫的丰度平均为 2.27×103个/ mL，表现为近岸处较高、随离岸距离的增加而下降的趋势;Shannon 多样性指数呈现表层低于底层、近岸区低于陆架区的特征，反映了生物群落的稳定程度以及对环境条件的适应程度;不同类群的鞭毛虫具有各自独特的营养模式和相对固定的粒级，表现出对温度、盐度、溶解氧等环境因素的不同响应，从而使群落的物种组成和分布模式呈现明显的季节变化和生境差异。 研究结果可为深入认识东海海洋微型鞭毛虫的群落结构、分布格局以及环境影响因素提供理论依据。

　　关键词：微型鞭毛虫;高通量测序;群落结构;环境因子;东海

　　郭馨; 黄成; 林晓晴; 郑欣怡; 刘强; 黄凌风， 生态学报 发表时间：2021-11-26

　　正如海洋中的经典食物链一样，海洋微型生物食物网在维持海洋生态系统的结构和功能中同样起到重要作用[1⁃2]。 其中，粒径小于 20 μm 的微型鞭毛虫(Microbial flagellates)以其庞大的多样性、多样的营养模式和快速的生长代谢率，成为微食物网中非常重要的一环，在全球海洋生态系统中占据广阔的生态位，在生物地球化学循环中发挥着关键作用，是海洋生态学领域研究的焦点[3⁃4]。 鞭毛虫不是分类学上的定义，而是包括具有相似生态学特征———具有一条或多条鞭毛，利用鞭毛进行运动或摄食活动的单细胞原生生物的群体总和[3， 5]。近年来，飞速发展和不断更替的分子生物学技术揭示了海洋微型鞭毛虫不可思议的庞大的多样性，远远超过传统方法(如分离培养和显微镜鉴定)所认知的数量[6]。 然而，大多研究并没有将鞭毛虫这一大类群单独从原生生物或者微型真核生物中提取出来，而是将其与其他类群如纤毛虫等作为一个整体群落进行分析[7]。 研究表明，大部分纤毛虫种类的粒径大于 20 μm，只有少数种类的粒径在 20 μm 以内，是微型鞭毛虫的主要捕食者[1]，在生态功能上与鞭毛虫类群有着一定的区别。 因此，将鞭毛虫类群与原生生物其他类群区分开来进行分析是非常有必要的。 目前，对海洋鞭毛虫群落的研究已逐渐从有关其形态特征(具有鞭毛)或者营养模式(自养、异养和兼养)等结构和功能上的“同质性”向其在系统进化上的高度“异质性”进行转变。 这种变化对于理解和认识该类群生物在现代(和未来)生态系统中独特的生态地位、生态学过程、生物地理格局、在生态系统中的功能以及适应自然海区环境变化的响应机制等具有至关重要的意义[6， 8]，有助于促进对海洋鞭毛虫的生态学研究从现象和作用(是什么?)向过程与机制(为什么?)不断深入。东海是一个具有倾斜地形特征、陆架开阔的边缘海[9]，受海陆分布以及冷、暖空气交替的影响，具有明显的季风性气候特征[10⁃11]。 同时，复杂的季节性变化的水团运动影响着该海区的水文条件和生态环境[9， 11]，也影响了海洋微型鞭毛虫群落的分布格局。 但是到目前为止，针对该海区微型鞭毛虫群落结构及其与环境因子的相关性研究仍不多见。 本研究采用高通量测序结合传统的显微镜观测方法调查了东海微型鞭毛虫的丰度、多样性等群落特征，并分析了影响微型鞭毛虫群落结构的关键环境因子，为揭示东海海洋微型鞭毛虫的群落结构、分布格局以及环境影响因素提供理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 采样时间和地点

　　本研究依托于国家自然科学基金委 2019 年春季(5 月)和秋季(9 月)的两个“东海科学考察”共享调查航次，搭载“向阳红 18”科学考察船开展了该海域环境因子和微型鞭毛虫群落的调查。 每个站位选择表层(海面下 3 m)和底层(距海底 5—10 m)两个水层进行采样。 两个航次的调查站点见图 1，使用 Surfer 20 作图，注意春秋两季相同名称的采样站点位置不一定相同。 为了分析的方便，根据地形将 50 m 等深线以内海域定义为近岸区，50—200 m 等深线之间的海域定义为陆架区。

　　1.2 环境因子的采集与测定

　　用 Niskin 采水器分别采集各层海水。 温度(Temperature， Temp)、盐度( Salinity， Sal)、溶解氧(Dissolvedoxygen， DO)数据用船载 CTD(SBE917plus， SeaBird Corp.， USA)现场测得。 营养盐的测定包括硝态氮(NO3 ⁃ N)、亚硝态氮(NO2 ⁃N)、氨氮(NH4 ⁃N)、活性磷酸盐(PO4 ⁃P)和活性硅酸盐(SiO3 ⁃Si)，各参数的检测均依据国家《海洋调查规范—第 4 部分：海水化学要素调查》(GB / T12763.4—2007)方法进行[12]。 叶绿素 a(Chlorophylla， Chl a)浓度的测定采用丙酮萃取荧光法[13]。 超微型浮游生物包括海洋异养细菌(Heterotrophic bacteria，HB)、蓝细菌(Cyanobacteria， Cyan)(包括聚球藻(Synechococcus， Syn)和原绿球藻(Prochlorococcus， Pro))和微微型真核生物(Pico⁃sized eukaryotes， pico⁃Euk)，其丰度采用流式细胞仪进行测定[14]，具体方法参考《海洋微型生物生态学》第 14 章《海洋微型生物流式图像技术》的内容[15]。 小型浮游动物(Micro⁃zooplankon， micro⁃ Zoo)(主要包括纤毛虫、腰鞭毛虫等)使用虹吸法进行富集后[16] 用 FlowCam 流式影像仪代替传统显微镜镜检方法测定其丰度，再通过 VisualSpreadsheet 软件对目标生物颗级(粒径 20—100 μm)进行计数[17]。 以上生物因子的测定方法同时参考了《海洋调查规范—第 6 部分：海洋生物调查》(GB / T12763.6—2007)的内容[12]。

　　1.3 微型鞭毛虫群落样本的采集与处理

　　1.3.1 丰度样本

　　微型鞭毛虫(Nanoflagellate， NF) 的丰度测定以及营养结构和粒级结构的划分方式参考了 Huang[13] 和Granda[18]等人的研究。 海水样本经 20 μm 筛绢预过滤之后，依次进行固定、过滤、染色、制片等步骤。 玻片在荧光显微镜(Leica FW 4000)100 倍物镜下镜检;在紫外激发光下，微型鞭毛虫的细胞核显蓝光，以此确定细胞的存在;之后转到蓝色激发光下，观察细胞是否呈现红色荧光，有红色荧光的为含色素体微型鞭毛虫(Pigmented nanoflagellate， PNF)，包括自养型和兼养型微型鞭毛虫，没有红色荧光的则为异养微型鞭毛虫(Heterotrophic nanoflagellate， HNF);统计 HNF 和 PNF 在三个粒级(2—5、5—10、10—20 μm)内的个数。 微型鞭毛虫的丰度(个/ mL)= (每个视野 NF 数量平均值×黑膜有效过滤面积) / 每个视野的面积×过滤水样体积)。微型鞭毛虫丰度的海区平面分布图由 Ocean Data View(version 5.2.1)制作。

　　1.3.2 多样性样本

　　每个站位各水层采集 5 L 海水，先经 20 μm 筛绢预过滤后，依次通过直径为 47 mm 的 2 μm 和 0.8 μm 孔径的聚碳酸酯核孔膜(Millipore Corp.， Germany)，得到 0.8—2 μm、2—20 μm 粒级 的微微型和微型浮游生物样本。 于液氮中保存，回到实验室后于-20℃储存。采用 Qiagen 公司的 PowerWater