中国南海矮小短指软珊瑚(Sinularia nanolobata)的化学成分研究
摘要：运用硅胶柱色谱，凝胶柱色谱和高效液相色谱等分离技术，对中国南海西瑁岛矮小短指软珊瑚的丙酮提取物中的化学成分进行了系统研究，从中分离得到 10 个化合物. 采用多种波谱技术确定了这些化合物的化学结构. 分别鉴定为：罗伯塔特(1)、(1 7R)-loba-8,10,13(15)-triene-17,18-diol(2)、α-生育醌(3)、(1E,3Z,7E,11R,12R)-11-羟基-12-甲氧基-1-异丙基-4,8,12-三甲基-环十四碳1,3,7-三烯(4)、(+)-(1E,3E,7E,11R,12S)-11,12-epoxy-11,12-dihydrocembrene-C(5)、(1E,3E,7R,8S,11E)-7,8-环氧-1-异丙基-4,8,12-三甲基-环十四碳-1,3,11-三烯(6)、24-亚甲基-胆固醇(7)、孕烯醇酮(8)、3β,6α,11-三羟基-24-亚甲基-9,11-断-5α-胆甾-7-烯-9-酮(9), Sinu grandisterol A(10). 其中化合物 1 为新的异戊烯基榄烷型二萜化合物. 生物活性实验结果表明，化合物 3 对蛋白酪氨酸磷酸酶 1B (PTP1B) 的酶活力具有较好的抑制活性，其 IC50 为 4.83±2.35 μΜ，提示该化合物在治疗糖尿病和肥胖症的药物开发中具有一定的潜力.
关键词：中国南海;矮小短指软珊瑚;异戊烯基榄烷型二萜;PTP1B 抑制活性
曾子溶;张梦梦;王鸿;李佳;郭跃伟有机化学2021-11-19
短指软珊瑚(Sinularia 属)的动物属于于腔肠动物门珊瑚虫纲八放珊瑚亚纲软珊瑚目，主要分布于东非到太平洋的广阔海域[1]，富含结构新颖和生物活性多样的萜类和甾体化合物，是海洋天然产物的重要来源. 随着分离分析技术的发展，从 Sinularia 中发现的化合物的种类也在不断增加. 其中很多活性显著的化合物可能成为药物开发的先导化合物[2-4] . 最近有报道称异戊烯基榄烷型二萜具有较好的抗炎活性[5]，然而该类化合物在海洋软珊瑚中尚未得到充分的发掘. 因此，深入研究 Sinularia 中的异戊烯基榄烷型二萜类化学成分具有重要的研究价值. 本课题组长期致力于海洋生物活性物质的研究，已经从多种属的短指软珊瑚中发现了大量的活性天然产物，尤其是萜类和甾体类化合物. 前期工作中，本课题组从采自中国南海的多型短指软珊瑚(S. polydactyla)中发现了三个新的异戊烯基榄烷型二萜[6] . 为了进一步探究该类化合物，丰富其种类和数量，以寻求结构新颖且具有较好生物活性的化合物，本文对采自中国南海西瑁岛海域的矮小短指软珊瑚(S. nanolobata)进行了化学成分研究. 从 S. nanolobata 的丙酮提取物中分离得到了 10 个化合物(图 1)，其中化合物 1 是一个新的异戊烯基榄烷型二萜. PTP1B 是蛋白酪氨酸磷酸酶家族中的一员，它在胰岛素信号通路中起负调控作用，是一个新颖的治疗糖尿病和肥胖症的靶点. 因此，寻找和开发高效的 PTP1B 抑制剂具有重要的研究价值[7] . 本文对分离到的 10 个化合物进行了 PTP1B 酶抑制活性检测，发现化合物 3 具有较好的 PTP1B 抑制活性，其 IC50 为 4.83±2.35 μΜ. 本文主要报道新化合物 1 的提取分离、结构鉴定和波谱数据，以及分离得到的 10 个化合物对 PTP1B 抑制活性的筛选结果.
1 结果与讨论
1.1 化合物 1 的结构鉴定
化合物 1，无色油状，HR-ESI-MS 显示 1 的准分子离子峰 [M+H]+ m/z 319.2630 (计算值 319.2632)，确定 1 的分子式为 C21H34O2，不饱和度为 5. 综合分析 13C NMR 和 DEPT 波谱数据，发现化合物有 21 个碳信号，包括 1 个羰基(C 177.5)，2 个 sp2杂化的季碳(C 140.6, 148.0)， 1个sp3杂化的季碳(C39.9)，2个sp2杂化的叔碳(C 122.0, 150.6)，3 个 sp3 杂化的叔碳(C39.2, 47.7, 53.0)，2 个 sp2 杂化的仲碳(C 109.9, 112.1)，5 个 sp3 杂化的仲碳(C25.6, 26.9, 33.1, 34.0, 40.1)，4 个甲基碳信号，1 个甲氧基碳信号. 经过与文献中相似化合物的波谱数据进行比对，发现化合物 1 与同时分离的异戊烯基榄烷型二萜 (17R)-loba-8,10,13(15)-triene-17,18-diol (2) [8]的 1H NMR 和 13C NMR 数据十分相似，区别主要发生在侧链上. 在 1H1H COSY 谱中，可见质子信号 H-15 (H5.13)、 H-16 (H1.99, 2.01)、H-17 (H 1.45, 1.74)、H-18 (H2.45) 有偶合关系(图 2). 在 HMBC 谱(图 2)中，质子信号 H-14 [H1.60(3H, s)]与碳信号 C-4 (C47.7)、C-13 (C 140.6)、C-15 (C122.0)有相关, H-19 [H1.15(3H, d, J=7.0Hz]与碳信号 C-17 (C34.0)、C-18 (C 39.2)、C-20 (C 177.5)有相关，因此，可以确定侧链的结构片段，化合物 1 的平面结构如图 1 所示. 化合物 1 的立体相对构型是通过 NOESY 以及异戊烯基榄烷骨架的经验规则[9]确定的, H-2 和 H-4 均为 β-取向, H-7 为 α-取向. 在 1H1H COSY 谱中, H3-14 和 H2-16 NOE 的相关将 Δ 13,15 定为 E 构型，通过 QM-NMR 量子力学方法计算两种可能的构型 1a(1R, 2R, 4S, 18R)或 1b(1R, 2R, 4S, 18S). 通过 DP4+，使用具有 6-31G*基集的 B3LYP 泛函，在 DFT 水平上进行 几 何 优 化 . 然 后 将 核 磁 共 振 数 据 在 PCM/mPW1PW91/6-31+G**水平上计算，对实验与计算的 1a, 1b 构型的 13C NMR 化学位移进行回归分析，得出了最佳拟合构型 1b (图 3). 最后，将计算数据和实验数据进行关联，并评估相应的 DP4+概率，1b 构型显示出最高的 DP4+概率(99.88%). 因此推测出化合物 1 的最佳匹配构型为 1b(1R, 2R, 4S, 18S). 同时确定了 CH3-19 为 β-取向，并将化合物 1 命名为罗伯塔特.
化合物 4，无色油状，为已知化合物，本文首次确定了其绝对构型. 通过对比具有相似结构单元的已确定绝对构型的化合物的化学位移[10-13]，对比碳谱数据 C-11 (C69.4)和 C-12 (C79.3)确定了 11 位的羟基为β取向，12 位的甲基为α-取向、甲氧基为 β-取向.
2 结论
通过色谱分离技术和波谱技术对矮小短指软珊瑚 S. nanolobata 的丙酮提取物进行了化学成分研究，共得到 10个化合物，这些化合物均为首次从该动物中分离得到. 包括 6 个二萜类化合物和 4 个甾体化合物. 其中化合物 1 为新化合物，通过经验规则和 DP4+计算确定了其立体构型. 同时，本文首次确定了化合物 4 的绝对构型. 通过 PTP1B 酶抑制活性实验筛选，发现化合物 3 对 PTP1B 具有较好的酶抑制活性，表明其在治疗糖尿病和肥胖症的药物发掘中具有一定的研究价值.
3 实验部分
Perkin-Elmer 241MC 旋光测定仪 (PerkinElmer， Fremont，美国);Nicolet iS5 红外光谱仪 (Thermo Scientific，Waltham，美国);JASCO J-815 圆二色谱仪 (JASCO，日本);Bruker AVANCE III 500 MHz 和 600MHz 核磁共振仪 (Bruker Biospin AG，Fällanden 德国)，以 TMS 信号作为参照;Agilent G6520 Q-TOF 高分辨质谱仪 (Agilent，美国);Agilent 1260 高效液相色谱仪 (Agilent，美国);Agilent Eclipse XDB-C18 半制备色谱柱 (5 µm，9.4 × 250 mm);薄层硅胶板 GF254 和柱色谱用硅胶 (200～300 目，300～400 目，青岛海洋化工有限公司，中国);Sephadex LH-20 凝胶 (Amersham Pharmacia Biotech，瑞典);色谱纯试剂 (DiKMA，美国)，其他有机溶剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司. 生物样品矮小短指软珊瑚于 2017 年采集于中国南海西瑁岛海域，经海南大学李秀保教授鉴定为 Sinularia nanolobata，标本(编号：17-XD-99)存放于中国科学院上海药物研究所新药研究国家重点实验室.
3.1 提取与分离
将冷冻的 S. nanolobata (干重量 700g) 切碎，用丙酮超声提取 5 次，每次 15 min，合并提取液减压浓缩后，将丙酮浸膏悬浮于 1 L 水中，分别用等体积的乙醚和正丁醇各萃取 3 次，收集萃取液分别减压浓缩后得到深棕色的乙醚相浸膏 11.3 g 和正丁醇相浸膏 3.3g. 乙醚相浸膏 (5.5 g) 经硅胶 (200～300 目)柱色谱，石油醚-乙醚 (100:0→95:5→8:2→7:3→6:4→5:5→0:100) 梯度洗脱，分为 6 个组分 Frs.A～F. Fr.A 组分 (1.6 g) 先后经 Sephadex HL-20 凝胶柱色谱 (石油醚-二氯甲烷甲醇 2:1:1) 和硅胶(300-400目)柱色谱 (石油醚-乙醚 100:0→95:5)，被分成 5 个亚组分 A1～A5, A2 经半制备 H PLC，以 100%乙腈等度洗脱(2.5 mL/min)得化合物 1 (4. 8 mg，tR = 16.0 min)和化合物 4 (1.7mg，tR =13.8 mi n). A4 经半制备 HPLC，95%乙腈-水等度洗脱(2.5 mL/ min)得化合物 5 (5.1 mg，tR = 16.5 min)和化合物 6 (1 6.7 mg，tR = 17.1 min). Fr.B 组分 (1.6 g) 经 Sephadex HL-20 凝胶柱色谱 (石油醚-二氯甲烷-甲醇 2:1:1) 层析, 得到化合物 7 (384.2mg). Fr.C 组分(348mg) 先后经 Sephadex HL-20 凝胶柱色谱 (石油醚-二氯甲烷-甲醇 2: 1:1) 和硅胶 (300-400 目) 柱色谱 (石油醚-乙醚 12:1→1 0:1→5:1→1:1)，被分为 4 个亚组分 C1～C4, C2 经半制备 HPLC, 以 80%乙腈-水等度洗脱(2.5 mL/min)得化合物 2 (2.8 mg，tR = 14.8 min). Fr.D 组分(703.6mg) 经 Sephadex HL-20 凝胶柱色谱 (石油醚-二氯甲烷-甲醇 2: 1:1) 层析, 得到 6 个亚组分 D1～D6, D5 再经过硅胶(30 0-400 目)柱色谱(石油醚-乙醚 5:1→3:1→1:1,得到化合物 3 (5.5 mg)和化合物 8 (36.0mg). Fr.F 组分(1.2g) 先后经 Sephadex HL-20 凝胶柱色谱 (石油醚-二氯甲烷甲醇 2:1:1) 层析和 Sephadex HL-20 凝胶柱色谱 (纯二氯甲烷) 层析, 得到 4 个亚组分 F1～F4, F4 经半制备 H PLC 80%乙腈-水等度洗脱(2.5 mL/min)得化合物 9 (10 1.4 mg，tR = 7.3 min)和化合物 10 (94.6 mg，tR = 13. 2 min).
3.2 结构鉴定
化合物 1 无色油状物, [α] 20 D +12.3(c 0.10, MeOH); HR-ESI-MS [M+H]+ m/z：319.2630 (Calcd. 319.2632)，分子式 C21H34O2; IR (KBr,cm-1 )vmax: 2970、2928、2859、 1739、1436、1375、1197、1159、907.4、890cm-1 ,其 1H NMR 和 13C NMR 数据见表 1. 化合物 2～10 为已知化合物, 根据其波谱数据与文献比对，将其分别鉴定为(17R)-loba-8,10,13(15)-triene-1 7,18-diol (2) [8]、α-生育醌 (3) [14]、(1E,3Z,7E,11R,12R)- 11-羟基-12-甲氧基-1-异丙基-4,8,12-三甲基-环十四碳-1, 3,7-三烯(4) [11]、(+)-(1E,3E,7E,11R,12S)-11,12-epoxy-11, 12-dihydrocembrene-C(5) [15]、(1E,3E,7R,8S,11E)-7,8-epo xy-1-isopropyl-4,8,12-trimethyl-cyclotetradeca-1,3,11-trien e (6) [15]、24-亚甲基-胆固醇 (7) [16]、孕烯醇酮 (8) [17]、 3β,6α,11-三羟基-24-亚甲基-9,11-断-5α-胆甾-7-烯-9-酮 (9) [18], Sinugrandisterol A (10) [19] .
3.3 生物活性测试
PTP1B 通过对胰岛素受体或其底物上的酪氨酸残基去磷酸化作用,对胰岛素信号转导进行负调节，本文利用重组 PTP1B 蛋白对分离的化合物 1～10 进行酶活力抑制活性筛选. 将重组的 PTP1B 蛋白(30 nmol/L)与底物对-硝基苯磷酸盐(p-NPP,2 mmol/L)以及待测化合物在 MOPs 缓冲液中 30℃孵育. 通过在 405 nm 下检测底物 p-NPP 被去磷酸化后所产生的对-硝基苯(p-NP)的含量，监测 PTP1B 的酶活力. 结果显示，化合物 3 对 PTP1B 具有很好的抑制活性，其 IC50 为 4.83±2.35 μΜ. 辅助材料(Supporting information) 化合物 1 的 1D/2D NMR 波谱图、红外光谱图、高分辨质谱图以及计算方法. 这些材料可以免费从本刊网站(http://sioc-journal.cn/) 上下载.