南海珊瑚来源真菌 Aspergillus sp. SCSIO 40435 的分离鉴定及其次级代谢产物研究

　　摘要：【目的】南海珊瑚共附生真菌 Aspergillus sp. SCSIO 40435 次级代谢产物分离鉴定及抑菌活性筛选。【方法】利用稀释涂布平板法分离珊瑚共附生真菌。采用单菌多代谢产物方法(One strain many compounds, OSMAC)对分离菌株进行化学多样性筛选，并采用滤纸片扩散法对真菌发酵产物进行抑菌活性分析。通过 ITS 测序鉴定活性菌株 SCSIO 40435 的分类地位，运用多种色谱手段从其粗提物中分离纯化单体化合物，并利用各种波谱手段(HRESIMS、1D 和 2D NMR、单晶 X-ray 衍射法等)确定化合物的结构。最后，采用微量肉汤稀释法对单体化合物的抑菌活性进行评估。【结果】从南海珊瑚样品中分离得到 19 株共附生真菌，结合化学多样性和抑菌活性分析，筛选出一株产物丰富且具有多种抑菌活性的菌株 SCSIO 40435。利用 ITS 测序分析将其鉴定为曲霉属真菌(Aspergillus sp.)，进一步从其发酵产物中分离鉴定了 4 个对三联苯类化合物：dicandidusin A(1)、candidusin A(2)、 terphenyllin(3)和 4"-deoxyterphenyllin(4)，其中化合物 1 为一个对三联苯同源二聚体类新化合物。此外，首次对化合物 4 的单晶结构进行了报道。【结论】本研究表明南海珊瑚中含有丰富的共附生真菌资源，且具有产生结构新颖的活性次级代谢产物的潜力，有望成为药物发现和开发的重要来源。

　　关键词：珊瑚共附生真菌;活性次级代谢产物;对三联苯二聚体

　　叶伟霞; 赵梦冉; 王璐; 蒋晓东; 张文军; 张长生; 田海妍， 微生物学报 发表时间：2021-11-25

　　南海海域辽阔，生物资源种类繁多，是我国最重要的海岛和珊瑚礁、红树林、海草床等生态系统分布区，也是全球海域生物多样性最高的地区之一[1]。珊瑚礁生态系统是由生物和非生物构建的复杂、独特的生态系统，是海洋中的“热带雨林”。珊瑚礁生态系统除为种类繁多的动植物提供栖息场所外还共附生着丰富的微生物种群[2]。这些微生物长期处于极端的生境下(高压、高盐度、寡营养、低温、黑暗等)，寄生或共生于宿主之中，从而与宿主之间产生特殊的交流方式[3-4]。这种相互关系往往使共附生微生物进化出独特的代谢途径和防御体制，具有产生新颖结构的活性物质的潜能[5-6]。近年来，研究人员逐渐把目光从珊瑚礁的生态学意义、珊瑚微生物群的特征等研究领域转向珊瑚共附生真菌活性次级代谢产物的发掘上，并取得了巨大进展。目前，从珊瑚共附生真菌中获得的活性物质种类多样，Wang 等从珊瑚共附生真菌次级代谢产物中分离得到具有新颖结构的硫代甘油酸酯取代的骨架重排混元二萜类化合物 Alternarin A，该化合物有显著的神经药理活性[7]。Cao 等以二级 MS 为指导从珊瑚来源的真菌中分离得到 4 个新颖的 7 元环肽，并半合成了一系列环七肽衍生物，其合成衍生物显示出中等强度的抗结核杆菌活性[8]。Cheng 等从珊瑚来源真菌中分离得到新颖的三元螺环橘霉素衍生物[9]。至今已从珊瑚来源真菌中分离得到萜类、聚酮、肽类、蒽醌类以及生物碱等多种结构类型天然产物，这些天然产物呈现出抗癫痫、抗病毒、抗结核、抗炎以及抗肿瘤等多种生物活性[10-13]，珊瑚来源真菌已经成为当前最具开发前景的天然产物新药源之一。

　　近期，我们从南海来源珊瑚中筛选出 1 株产物丰富且具有多种抑菌活性的真菌 SCSIO 40435，结合 ITS 测序鉴定为曲霉属真菌 Aspergillus sp. SCSIO 40435，进一步从其大米培养物中分离鉴定了 4 个对三联苯类化合物(1-4, 图 1)。结合 HRESIMS、1D 和 2D NMR、X-ray 单晶衍射等波谱数据，确定化合物 dicandidusin A(1)为新的对三联苯同源二聚体，2-4 为已知化合物，分别为 candidusin A(2)、terphenyllin(3)和 4"-deoxyterphenyllin(4)。本文报道曲霉属真菌 Aspergillus sp. SCSIO 40435 的分离筛选及其次级代谢产物的分离鉴定与活性评价。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 样品来源

　　供试珊瑚由中国科学院南海海洋研究所蒋晓东博士采集于中国南海，样品采集后立即放置于无菌塑料样品袋中，保存于 4 °C，低温运输至实验室后用于真菌的分离。

　　1.1.2 培养基

　　(1)菌株分离固体培养基

　　PDA 培养基(g/L)：马铃薯葡萄糖水 24 g，琼脂粉 20 g，海盐 30 g。GPSA 培养基(g/L)：葡萄糖 10g，细菌学蛋白胨 1 g，可溶性淀粉 10 g，K2HPO4 10 g，MgSO4 1 g，琼脂粉 20 g，海盐 30 g，pH 7.0~7.4。甘油-酪素培养基(g/L)：甘油 10 g，酪蛋白胨 10 g，KNO3 2 g，NaCl 2 g，K2HPO4 2 g，MgSO4•7H2O 0.05 g，FeSO4•7H2O 0.01 g，CaCO3 0.2 g，琼脂粉 20 g，海盐 30 g，pH 7.0~7.4。

　　(2)菌株发酵筛选培养基

　　PDB 培养基(g / L)：马铃薯葡萄糖水 24 g，海盐 30 g。大米培养基：大米 10 g，海盐 0.45 g，蒸馏水 15 mL。小米培养基：小米 10 g，海盐 0.45 g，蒸馏水 15 mL。燕麦培养基：燕麦 10 g，海盐 0.6 g，蒸馏水 20 mL。

　　(2)抑菌活性筛选培养基

　　LB 培养基(g/L)：胰蛋白胨 10 g，酵母提取物 5 g，NaCl 10 g，调 pH 7.0。 MH 培养基(g/L)：水解酪蛋白胨肉汤 21 g。

　　1.1.3 指示菌种类

　　测试病原菌包括：大肠杆菌(Escherichia coli ATCC 25922)，金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus ATCC 29213)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 1064)，鲍曼不动杆菌( Acinetobacter baumannii ATCC 19606 ) ， 耐 甲 氧 西 林 金 黄 色 葡 萄 球 菌(Methicillin-resistant Stphylococcus aureus MRSA ATCC 43300)和藤黄微球菌(Micrococcus luteus SCSIO ML01)。

　　1.1.4 主要试剂和仪器

　　PCR 扩增仪(Thermo Fisher Scientific ABI Veriti 96 well 型，德国 Eppendorf 公司);多功能组合式摇床(HYG-C，太仓实验设备厂);超导核磁共振仪(Bruker AVANCE 700M 型，德国 Bruker 公司);高分辨飞行时间质谱(Bruker maXis，德国 Bruker 公司);柱色谱硅胶(100~200 目，烟台江友硅胶开发有限公司)，硅胶薄层板(HS-GF 254，烟台江友硅胶开发有限公司);高效液相色谱仪(Agilent 1260，美国 Agilent 公司);半制备高效液相色谱仪(Hitachi Primaide，日本日立公司);色谱柱(Phenomenex ODS column 250 mm × 10.0 mm, 5 μm; Phenomenex, USA);培养箱(MJ01，湖北黄石恒丰医疗器械有限公司)。试剂：色谱纯乙腈(安徽时联公司);其它试剂均为国产分析纯(广州化学试剂厂)。

　　1.2 真菌的分离和纯化

　　将采集到的样品置于超净台中，用经 75%乙醇消毒的剪刀剪取珊瑚样品约 10 g，置于装有已灭菌人工海水的烧杯中，对其表面进行清洗，用已灭菌的搅拌机将样品充分碾碎，得组织原液。随后将原液稀释至 10-1、10-2，用移液枪吸取 200 μL 加到分离培养基的平板上，用一次性涂布棒涂布均匀，吹干后置于 28 C 培养箱中倒置培养 7~30 d，每隔 3 d 左右观察菌落生长状态。所有长出的真菌菌落均接种于 PDA 平板上，并多次纯化直至获得纯的菌株。

　　1.3 菌株发酵筛选及活性测试

　　将分离得到的真菌菌株接种至 PDB 液体培养基中(50 mL/250 mL)，28 °C，200 r/min 振荡培养 2 d 作为发酵培养的种子液，将生长良好的种子液以 10%(V/V)的接种量接种至 3 种固体培养基中，静置培养 30 d。收菌后以体积比(V/V)1:1 加入丁酮浸泡提取、旋干，提取物均分成两份。一份用甲醇溶解，HPLC 进样检测;另一份提取物加 DMSO 配成 20 mg/mL 的溶液，并采用滤纸片扩散法[14]进行抑菌活性筛选。

　　1.4 真菌 SCSIO 40435 的菌种鉴定

　　1.4.1 真菌基因组 DNA 提取及 ITS 基因序列扩增

　　利用真菌基因组 DNA 提取试剂盒提取菌株的基因组 DNA，以通用引物 ITS1 (5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和 ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)对菌株 ITS 区域进行扩增。PCR 扩增体系为 20 μL：dd H2O 13 μL，DNA 模板 0.5 μL，dNTPs 1.2 μL，5 × FastPfu 缓冲液 4 μL，FastPfu 酶 0.4 μL，ITS1 引物 0.5 μL，ITS4 引物 0.5 μL。PCR 程序为：95 °C 5 min;95 °C 40 s，55 °C 35 s，72 °C 1 min，30 个循环;72 °C 10 min。PCR 产物由广州擎科生物技术有限公司回收纯化，完成测序。

　　1.4.2 系统发育分析

　　利用软件 SeqMan 将测序得到的序列结果进行校对拼接，将拼接得到的完整序列在 NCBI 数据库中进行 BLAST 比对，选择同源性较高且具有代表性的真菌作为参考序列，下载相应菌株的序列和信息。使用软件 MEGA-X 以邻接法(Neighbor-Joining，NJ)对菌株进行系统发育分析[15 -17]。

　　1.5 真菌 Aspergillus sp. SCSIO 40435 大规模固体发酵与萃取

　　将菌株 Aspergillus sp. SCSIO 40435 接种至 PDB 液体培养基中(50 mL/250 mL)，28 °C， 200 r/min 振荡培养 2 d 作为放大发酵培养的种子液，将生长良好的种子液以 20%(V/V)的接种量接种至 15 kg 大米固体培养基中，静置培养 30 d。收集菌体以体积比(V/V)1:2 加入丙酮浸泡提取 3 次，减压浓缩回收丙酮。将 3 次浓缩浸膏合并，水混旋，乙酸乙酯萃取 3 次，经减压浓缩后获得 118 g 粗浸膏。

　　1.6 真菌 Aspergillus sp. SCSIO 40435 中活性次级代谢产物的提取分离

　　乙酸乙酯萃取部位(118 g)，经硅胶柱色谱梯度洗脱(氯仿-甲醇：100/0, 95/5, 90/10, 85/15, 70/30, 50/50, 0/100)，通过薄层色谱法(TLC)检识，结合 HPLC 分析检测合并得馏分 Fr. 1 ~ Fr. 4。其中 Fr. 1 经硅胶柱色谱，石油醚/乙酸乙酯(100/0, 5/1, 4/1, 7/3, 6/4, 5/5, 3/7, 2/8, 0/100)以及乙酸乙酯/甲醇(100/0, 7/3, 5/5, 3/7, 0/100)梯度洗脱，经 TLC 及 HPLC 分析合并得 11 个子馏分 Fr.1-A ~ Fr. 1-K，其中 Fr.1-F 经反相中压色谱(ODS)，采用乙腈/水体系(A 相： 0.08% HCOOH/H2O;B 相：CH3CN)梯度洗脱(VB : VA = 5 : 95~95 : 5，流速 10 mL/min)得到 20 个馏分 Fr. 1-F-01– Fr. 1-F-20。Fr.1-F-08 经凝胶色谱(Sephadex LH-20)，采用氯仿/ 甲醇(1:1)体系得到 4 个馏分 Fr.1-F-08-L1 – Fr.1-F-08-L4，其中 Fr.1-F-08-L4 经半制备液相，以乙腈/水体系(A 相：0.08% HCOOH/H2O;B 相：CH3CN)梯度洗脱(0~15 min, 50% B 相;15~25 min, 50%~70% B 相; 25.1~33 min, 100% B 相)得到化合物 1(2.9 mg)和化合物 2(46.1 mg)。Fr.1-F-08-L3 经半制备液相，以乙腈/水体系(A 相：0.08% HCOOH/H2O;B 相：CH3CN)等度洗脱(VB : VA = 50 : 50)得到化合物 3(25.2 mg)。将馏分 Fr.1-D 通过重结晶法，纯化得到化合物 4(41.0 mg)。化合物 1-4 结构如图 1。

　　1.7 真菌 Aspergillus sp. SCSIO 40435 中次级代谢产物的活性评价

　　采用微量肉汤稀释法[18]测定化合物 1-4 的最小抑菌浓度(MIC)。将化合物以 DMSO 为溶剂配成终浓度为 2.56 mg/mL 的母液，-20 °C 保藏备用。在 96 孔板上第 1 列的每孔加入 MH 液体培养基 200 μL，第 2 列的每孔加入 MH 液体培养基 100 μL，第 3 列加入 190 μL MH 液体培养基，其余每列加入 MH 液体培养基 100 μL。然后在第 3 列每孔加入样品母液 10 μL，吹吸混匀，再从第 3 列吸取 100 μL 液体到第 4 列，吹吸混匀，同理依次往下 2 倍稀释到第 12 列，最后 1 列取 100 μL 弃去。按照同样的方法分别加入 DMSO 和环丙沙星作为对照组。

　　用无菌的 MH 液体培养基将培养好的菌液稀释 1000 倍，除第 1 列外每孔加入稀释菌液 100 μL，使化合物的终浓度分别为 64.0、32.0、16.0、8.0、4.0、2.0、1.0、0.5、0.25、0.125 μg/mL。以上实验每组做 3 个平行，37 ℃培养。16 h 后观察菌株生长情况，按照 CLSI 中“甲氧苄胺嘧啶或磺胺药物的肉汤稀释法”的终点判断，与阳性生长对照管比较，抑制 80%细菌生长管药物浓度为受试菌 MIC。

　　2 结果和分析

　　2.1 菌株的分离鉴定与筛选

　　对分离获得的 19 株真菌分别采用 3 种不同的固体培养基(大米、小米及燕麦培养基)培养，通过 HPLC-DAD 检测样品的化学多样性，通过纸片法筛选抑菌活性，发现菌株 SCSIO 40435 的次级代谢产物丰富(图 2)，且对 4 种革兰氏阳性菌：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 1064)，金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus ATCC 29213)，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Stphylococcus aureus MRSA ATCC 43300)和藤黄微球菌(Micrococcus luteus SCSIO ML01)均具有抑制作用，其中对枯草芽孢杆菌和藤黄微球菌的抑菌作用较强(表 1)。将菌株 SCSIO 40435 的 ITS 测序结果在 NCBI 数据库中进行 BLAST 比对，并下载同源性较高的序列构建进化树分析(图 3)，发现菌株 SCSIO 40435 的 ITS 序列与 Aspergillus candidus(MT524443.1)的相似性最高，以 100%可信度聚在一个分支。综合以上分析结果，将菌株鉴定为 Aspergillus sp. SCSIO 40435。

　　2.2 真菌 Aspergillus sp. SCSIO 40435 中化合物结构鉴定

　　通过大米固体培养基对真菌 Aspergillus sp. SCSIO 40435 进行放大发酵，从中分离得到 4 个对三联苯类化合物：dicandidusin A(1)、candidusin A(2)、terphenyllin(3)和 4"-deoxyterphenyllin(4)，其中化合物 1 为对三联苯同源二聚体新化合物。

　　2.2.1 新化合物结构解析

　　化合物 1 为灰褐色无定形固体，正离子高分辨电喷雾质谱(HRESIMS)显示其准分子离子峰为 m/z 703.1786 [M + H]+(C40H31O12 计算值为 703.1810)，不饱和度为 26。分析化合物 1 的 1H、13C NMR 以及 HSQC 数据(表 2，图 S1)发现有 2 个氧甲基、6 个 sp2 杂化的次甲基、12 个季碳和 3 个活泼质子信号，仅为元素组成信号的一半，提示化合物 1 可能是同源二聚体。对其核磁数据进一步分析发现化合物 1 的核磁数据与已知化合物 Candidusin A(2)的核磁数据高度相似，不同之处在于化合物 1 比 2 少了一个 sp2 杂化的次甲基(δH 6.76, H-17; δC 114.8, C-17)，推测 1 通过 C-17/C-17′相连。由于 1 中三个活泼质子信号位于同一处，因此无法利用 HMBC 相关(图 S1)判断二聚体的连接位置。分析 1 的 NOESY 相关，发现 H-5、H-14 与 H3-20 有相关(图 4-A，图 S1)，表明化合物 1 中两个 sp2 杂化的次甲基分别位于 C-14(δH, 7.29; δC, 102.4)及 C-5 位(δH, 6.63; δC, 105.1)，进而证实化合物 1 的 2 个单体通过 C-17/C-17′相连，进一步详细地归属 1 的核磁信号确证了平面结构。化合物 1 的 D 环与 D′环之间的联苯键可能具有轴手性，对化合物 1 的旋光值进行测定，发现其旋光值近乎为零(-0.0007°)，[α]D 25 -2 (c 0.025, MeOH)，推测其为外消旋体。鉴于化合物 1 的含量较少，未对其进行手性拆分。最后，我们推测了化合物 1 的生物合成机理(图 4-B)：化合物 1 的生物合成起源于酪氨酸，在生物体内酪氨酸经转氨酶的作用转化为 4-羟基苯丙酮酸，两个 4- 羟基苯丙酮酸缩合，生成对三联苯前体，经烯醇互变、还原、脱水等形成对三联苯单体化合物 2 [19]，化合物 2 可能在 P450 氧化酶的催化下形成自由基化合物 2a，两个 2a 发生自由基偶合、烯醇互变形成化合物 1 [20]。已报道的 P450 氧化酚羟基引发的自由基偶合反应多数发于分子内、形成分子内的 C-C 键，分子间的、能形成具有轴手性的联苯键自由基偶合反应也有报道，但相对较少[20]。

　　2.2.2 已知化合结构鉴定

　　Candidusin A(2):灰褐色固体，HRESIMS m/z [M + H]+ 353.1028 (C20H17O6 计算值 353.1020)。1H NMR (700 MHz, DMSO-d6)：δH 9.37 (3H, s, 10-OH/15-OH/16-OH), 7.42 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-8/12), 7.38 (1H, s, H-14), 7.08 (1H, s, H-17), 6.86 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-9/11), 6.70 (1H, s, H-5), 3.97 (3H, s, 20-OCH3), 3.75 (3H, s, 19-OCH3)。13C NMR (175 MHz, DMSO-d6)：δC 157.1 (C-10), 149.9 (C-18), 149.8 (C-4), 148.9 (C-2), 146.3 (C-16), 143.0 (C-15), 136.4 (C-1), 131.0 (C-6), 130.8 (C-8/C-12), 129.1 (C-7), 115.6 (C-9/C-11), 114.5 (C-3), 114.1 (C-14), 107.5 (C-5), 106.0 (C-13), 99.0 (C-17), 61.0 (C-20), 56.3 (C-19)。波谱数据与文献[21]报道基本一致。 Terphenyllin(3):白色固体，HRESIMS m/z [M + H]+ 339.1226 (C20H19O5计算值 339.1227)。 1H NMR (700 MHz, DMSO-d6)：δH 9.58 (1H, s, 10-OH), 9.34 (1H, s, 16-OH), 8.51 (1H, s, 2-OH), 7.44 (2H, d, J = 8.6 Hz, H-8/12), 7.10 (2H, d, J = 8.6 Hz, H-14/18), 6.85 (2H, d, J = 8.7 Hz, H-9/11), 6.76 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-15/17), 6.39 (1H, s, H-5), 3.64 (3H, s, 20-OCH3), 3.29 (3H, s, 19-OCH3)。13C NMR (175 MHz, DMSO-d6)：δC 157.2 (C-16), 156.3 (C-10), 153.5 (C-4), 148.6 (C-2), 139.7 (C-1), 132.8 (C-6), 132.3 (C-14/C-18), 130.2 (C-8/C-12), 129.2 (C-7), 125.0 (C-13), 117.3 (C-3), 115.6 (C-9/C-11), 114.8 (C-15/C-17), 103.4 (C-5), 60.5 (C-20), 56.0 (C-19)。波谱数据与文献[22]报道基本一致。

　　4"-deoxyterphenyllin(4): 白色固体，HRESIMS m/z [M + H]+ 323.1285 (C20H18O4 计算值 323.1278)。1H NMR (700 MHz, DMSO-d6)：δH 9.33 (1H, s, 16-OH), 8.61 (1H, s, 2-OH), 7.62 (2H, dt, J = 7.0, 1.3 Hz, H-8/12), 7.47 (2H, t, J = 7.6 Hz, H-9/11), 7.38 (H, tt, J = 7.4, 1.2 Hz, H-10), 7.12 (2H, dt, J = 8.5, 2.0 Hz, H-14/18), 6.78 (2H, dt, J = 8.5, 2.0 Hz, H-15/17), 6.45 (1H, s, H-5), 3.64 (3H, s, 20-OCH3), 3.30 (3H, s, 19-OCH3)。13C NMR (175 MHz, DMSO-d6)：δC 156.5(C-16), 153.6 (C-4), 148.7 (C-2), 139.9 (C-10), 138.7 (C-1), 132.9 (C-6), 132.3 (C-14/C-18), 129.1 (C-8/C-12), 127.7 (C-7), 124.9 (C-13), 118.2 (C-3), 128.8 (C-9/C-11), 114.8 (C-15/C-17), 103.7 (C-5), 60.8 (C-20), 56.1 (C-19)。波谱数据与文献[21]报道基本一致。 Crystal data of 4"-deoxyterphenyllin(4):三斜晶系，空间群 P-1 (no. 2)，晶体大小为 0.01 mm × 0.01 mm × 0.01 mm;晶胞参数：a = 8.9333 (7) Å, b = 9.8055 (8) Å, c = 10.2676 (10) Å, α = 85.119 (7)°, β = 65.971 (9)°, γ = 72.469 (7)°, 晶胞体积 V = 782.57 (13) Å3, Z = 2, 计算密度 1.368 g/cm3，Cu-Kα 辐射( λ = 1.54184 Å );收集总衍射点 7224，独立衍射点 3050;R1 = 0.0466，wR2 = 0.1487。该晶体数据已上传至剑桥晶体学数据库(CCDC - 2116133)。

　　2.3 真菌 Aspergillus sp. SCSIO 40435 中化合物抑菌活性实验

　　采用微量肉汤稀释法[18]评估了化合物 1-4 对 2 株革兰氏阴性致病菌(大肠杆菌(Escherichia coli ATCC 25922)和鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii ATCC 19606))和 4 株革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus ATCC 29213)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Stphylococcus aureus MRSA ATCC 43300)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 1064)和藤黄微球菌(Micrococcus luteus SCSIO ML01))的抑菌活性。结果表明(表 3)化合物 1 对 6 株致病菌无明显抑制活性，MIC 均大于 64 μg/mL。化合物 2 和 3 对革兰氏阴性的大肠杆菌具有显著生长抑制活性，MIC 分别为 1 μg/mL 和 0.5 μg/mL，其中化合物 2 对鲍曼不动杆菌有生长抑制活性，MIC 为 64 μg/mL。此外，化合物 2 对革兰氏阳性的金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌也表现出中等强度生长抑制活性， MIC 分别为 32 μg/mL 和 16 μg/mL;但其对枯草芽孢杆菌及藤黄微球菌无明显抑制作用， MIC 大于 64 μg/mL。不同的是，化合物 4 对枯草芽孢杆菌及藤黄微球菌则表现出一定的抑制作用，其 MIC 分别为 64 μg/mL 和 32 μg/mL，而对其它 4 株指示菌无明显生长抑制活性， MIC 大于 64 μg/mL。

　　3 讨论

　　珊瑚等海洋无脊椎动物是海洋生态系统的重要组成部分，蕴含着大量的共附生微生物资源。曲霉属真菌不仅是海洋常见真菌种属之一，也是活性次级代谢产物主要产生菌[23]。迄今为止，从海洋来源曲霉属真菌中已发现多种结构类型的次级代谢产物，如生物碱[24]、聚酮[25]、萜类[26]、蒽醌类[27]、异香豆素类[28]、肽类[29]和对三联苯类[30]等。Terphenyllin 是最先发现的对三联苯类化合物，由 C Takahashi 等[31]在 1976 年分离于 Aspergillus candidus。此外，2016 年 Lars Andernach 等[32]从菌株 Allantophomopsis lycopodina 中分离获得对三联苯与萘并呋喃三联苯的二聚体 allantonaphthofuran A-C。至今，已报道的对三联苯衍生物已超过 230 个[33]，但对三联苯类化合物二聚体鲜有报道。对三联苯类衍生物具有多种生物活性，如神经氨酸酶抑制、α-葡萄糖苷酶抑制、抗氧化、细胞毒性、抗菌和免疫抑制活性[33-34]。本文对化合物 1-4 的抑菌活性进行了评估，发现已知化合物 2 不仅对革兰氏阳性菌耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抑制作用(16 μg/mL)微强于金黄色葡萄球菌(32 μg/mL)，还对革兰氏阴性菌大肠杆菌具有较强的抑制作用，MIC 达到 1 μg/mL。此外，对鲍曼不动杆菌也表现出微弱的抑制活性(64 μg/mL)，为潜在的抗菌药物先导化合物。遗憾的是，其同源二聚体化合物 1 并没有观察到明显的抑菌活性。

　　综上所述，本研究通过化学多样性与抗菌活性分析，从南海珊瑚中筛选了一株真菌 Aspergillus sp. SCSIO 40435进行次级代谢产物分离，从中鉴定了4个对三联苯类化合物(1-4)，其中化合物 dicandidusin A(1)为首次报道的新颖对三联苯化合物同源二聚体。本研究还对 4 个单体化合物进行了抗菌活性评估，结果显示已知化合物 2 的抑菌活性明显强于化合物 3 和 4，推测化合物 2 中形成的呋喃环单元可能对抑菌活性发挥重要作用。但其同源二聚体化合物 1 无明显抑菌活性，因此，关于其具体活性作用机理的研究，还有待进一步探索。本研究不仅丰富了现有对三联苯类化合物的多样性，而且为后续利用珊瑚来源的真菌生产活性代谢产物奠定了基础。