摘要：为探究水处理对茶树冻害胁迫的效应，以中茶108为材料，在不同水处理条件下，采用人工气候室模拟冬季冻害的发生，测定茶树叶片中多项生理生化指标的变化规律。结果表明，茶树叶片中过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)的活性，脯氨酸、丙二醛、可溶性糖和可溶性蛋白的含量均受低温胁迫诱导，开始降温时，除丙二醛含量下降外，其余均呈上升趋势。“低温—冻害—低温”胁迫过程中，浇水处理的茶树叶片中POD和SOD活性，脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白含量均高于不浇水处理，丙二醛含量变化趋势则与之相反，不同处理间差异极显著;CAT活性无显著差异。浇水处理有利于茶树多个抗寒生理指标的改变。
关键词：茶树;水处理;冻害胁迫;生理指标
植物凍害(Plant frost)是造成高纬度地区越冬农作物减产、绝产的气象灾害之一，冬季土壤水分含量与作物存活率密切相关[1-2]，合理灌溉是保障作物安全越冬的一项重要措施[3-5]。越冬作物自身通过调节可溶性糖、氨基酸、丙二醛等含量或相关酶活性的变化，参与渗透调节、低温保护以及细胞膜的合成、流动和稳定性等多个方面，增强自身对一定程度冻害的耐受性[6-16]。
茶树喜温怕寒，冬季的极端低温和初春的“倒春寒”是影响茶树生长和繁殖的重要因素[17-18]。山东茶区是中国茶树栽培的最北线，纬度较高，季风性气候明显，冬季寒冷干燥，茶树极易受到冻害，越冬需要进行防护，生产成本高。冻害一直是制约山东茶产业高质量发展的主要瓶颈。山东茶区冬季缺水较严重，研究表明，茶树代谢活动受到影响，抗逆性显著降低，在立冬后茶园浇足浇透越冬水，有利于减轻冻害[19-23]。茶树受到冻害胁迫时，众多的基因、基因家族和代谢通路等也参与了这一复杂的生理生化过程[24-34]，但茶树抗冻机理至今尚未完全明确。而模拟自然条件下，“低温—冻害—低温”胁迫发生时，伴随着温度和时间的改变，不同水处理条件下茶树体内一些与抗寒相关生理指标的变化鲜见报道，相关研究对冬季山东省茶树安全越冬具有指导和借鉴的意义。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试材料为山东日照市农业科学院茶叶研究所茶园的2年生中茶108茶苗。
1.2 试验设计
随机选取100株生长良好且长势一致的茶树苗移栽至人工气候室内。光照12 h(3 500 lx，24 ℃)，黑暗12 h(16 ℃)，空气湿度80%，正常田间管理，培养180 d。设置浇水(Tn，土壤深20 cm处含水量为30%)和不浇水(Cn，土壤深20 cm处含水量为15%)2个处理，浇水10 d后开始“低温—冻害—低温”的胁迫处理，空气湿度降至60%。
从10 ℃24 h时开始，梯度降温(1 ℃/h)至0 ℃时1 h，?7 ℃时0 h、6 h、12 h、18 h、24 h、30 h和36 h;随后梯度升温(1 ℃/h)至0 ℃时1 h，10 ℃时0 h、12 h和24 h时分别摘取茶树顶端第2～4片成熟叶(至少5株，3次重复)，低温蒸馏水快速洗净，滤纸吸干，液氮冷冻，?70 ℃超低温冰箱保存，备用。
1.3 植物生理生化指标检测
低温称取1.00 g样品，加入1 000 μL PBS溶液(pH=7.2)，充分研磨粉碎，移入1.5 mL离心管中，4 000 r/min离心30 min，收集上清，冷冻备用。
依据酶聯免疫试剂盒(ELISA，酶联生物)使用说明，测定样品中过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性;脯氨酸、丙二醛、可溶性糖和可溶性蛋白的含量。
1.4 数据统计分析
使用Excel 2019和GraphPad Prism5进行数据分析和图表绘制。
2 结果与分析
2.1 不同水处理茶树叶片POD活性的变化
在“低温—冻害—低温”胁迫过程中，浇水处理的叶片中POD活性均高于不浇水处理(图1)。POD活性明显受低温胁迫诱导，处理开始温度10 ℃/24 h时，浇水和不浇水处理的POD酶活性分别为177.73 U/mL和126.78 U/mL;降至0 ℃/1 h时，不同水处理的POD活性均升高，不浇水处理的达到最大值170.82 U/mL。
随着冻害胁迫(?7 ℃)持续时间的延长，POD活性均呈下降趋势;冻害胁迫结束后，随着温度的升高，浇水处理的POD活性上升趋势明显，在10 ℃/12 h时达到最大值220.85 U/mL，随后下降，10 ℃/24 h时POD的活性降至124.68 U/mL;不浇水处理的POD活性随着气温升高，呈持续下降趋势，气温升至10 ℃/0 h时POD活性降至最低49.33 U/mL，约为最高值的1/3，随后活性维持低位水平，10 ℃/24 h时的POD活性达到73.72 U/mL。
2.2 不同水处理茶树叶片SOD活性的变化
在“低温—冻害—低温”胁迫过程中，浇水处理的SOD活性均高于不浇水处理(图2)。SOD的活性明显受低温胁迫诱导。处理开始温度降至10 ℃/24 h时，浇水和不浇水处理的SOD活性分别为75.20 U/mL和50.81 U/mL;降至0 ℃/1 h时，不同水处理的SOD活性均升高，但升高幅度存在差异，不浇水处理的SOD活性达到最大值87.29 U/mL;随着冻害胁迫(?7 ℃)持续时间的延长，SOD活性呈下降趋势;冻害胁迫结束后，随着温度的升高，浇水处理的SOD活性呈上升趋势，在10 ℃/12 h时达到最大值131.19 U/mL，10 ℃/24 h时SOD的活性降至79.81 U/mL;而不浇水处理SOD活性随着温度升高呈下降趋势，10 ℃/24 h时的SOD活性降至最低值20.17 U/mL。
2.3 不同水处理茶树叶片CAT活性的变化
在“低温—冻害—低温”胁迫过程中，不同水处理间的茶树叶片CAT活性差异较小(图3)。CAT活性受低温胁迫诱导，处理开始当温度降至10 ℃/24 h时，浇水和不浇水处理的CAT活性分别为31.25 U/mL和25.75 U/mL;当温度降至0 ℃/1 h时，CAT活性均升高，达到最大值，分别为39.89 U/mL和47.30 U/mL，不浇水处理的CAT活性增加约1倍;随着冻害胁迫(?7 ℃)时间的延长，CAT活性均略有下降后维持在较高水平波动，不同水处理间差异较小;冻害胁迫结束，升温过程中，不同水处理间CAT活性呈持续下降，在10 ℃/24 h时降至最低值，分别为12.40 U/mL和18.62 U/mL，均低于检测初始时的CAT活性，且浇水处理的CAT活性下降幅度大于不浇水处理。
2.4 不同水处理茶树叶片脯氨酸含量的变化
在“低温—冻害—低温”胁迫过程中，浇水处理的叶片中脯氨酸含量均高于不浇水处理(图4)。处理开始降温至10 ℃/24 h时，浇水处理的叶片中脯氨酸含量(23.75 ng/mL)高于不浇水处理(21.91 ng/mL);伴随着温度的下降，不同水处理间脯氨酸含量的积累量和积累强度呈上升趋势;浇水处理脯氨酸含量在温度降至0 ℃/1 h时达到最大值37.66 ng/mL，冻害来临时(?7 ℃)含量略有下降，但仍维持在较高含量水平波动，冻害后升温过程中脯氨酸含量积累虽有波动，但均高于初始检测值。
不浇水处理在降温和冻害来临时脯氨酸含量增加强度较低，积累响应慢于浇水处理，在?7 ℃/0 h达到最大值(34.62 ng/mL)，然后缓慢下降波动，在冻害结束后，温度升至10 ℃/12 h时达到最低值16.42 ng/mL，约为最高值的1/2。
2.5 不同水处理茶树叶片丙二醛含量的变化
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