大球盖菇菌渣对盐碱土区林地土壤的改良研究

　　摘要：为研究滨海盐碱土区林地栽培大球盖菇出菇后，剩余的栽培基质(菌渣)就地还田对滨海盐碱土区林地土壤的改良效果，选用 3 种不同含盐量的林地栽培大球盖菇，将出菇后的菌渣就地混翻于 0~20 cm 土层盐碱土壤中，自然降解 4 个月后，测定试验林地土壤理化性质、养分含量及土壤真菌群落结构。结果表明：施入大球盖菇菌渣后，3 种滨海盐碱土区林地土壤的 EC 值、含盐量及容重均显著降低;土壤孔隙度、水稳性团聚体、有机质、速效磷、碱解氮含量均显著提高;3 个处理样地真菌群落的 β 多样性变化明显，强度盐化处理样地(Z2s)土壤真菌群落的 α 多样性显著提高。环境因子关联分析表明，滨海盐碱土区林地理化性质与土壤真菌群落分布显著相关。本研究结果表明施入大球盖菇菌渣能有效降低滨海盐碱土区林地的土壤含盐量，优化土壤理化性质，改善土壤真菌群落结构，改良效果显著。

　　关键词：大球盖菇菌渣;盐碱土改良;土壤理化性状;土壤真菌群落

　　齐广耀; 张书菡; 孙建平; 刘雅辉; 苏斌; 吕骐羽; 姜淑霞 山东农业科学 2022-01-10

　　我国滨海盐碱土总面积达 500 万 hm2，多年来主要采取一些物理措施整土、覆盖、深耕、添加磷石膏、沸石粉及井沟渠灌等措施，来改变盐碱地的土壤结构，降低其含盐量[1]，这些措施达到了一定的改良效果。但物理措施和水利工程方法需较大的工程量和较高的投资成本，化学手段存在二次污染等问题。而食用菌栽培过程中，出菇后剩余的栽培基质又称为菌渣，具有容重小、通气性好，富含大量纤维素、菌丝蛋白等有机质和多种微生物及酶等其他活性物质的特性[2，3]。国内外的研究发现菌渣对改良土壤理化性状，增加土壤养分含量, 改良土壤微生物群落结构, 促进植物营养吸收都有着积极作用[4-7]。大球盖菇(Stropharia rugosoannulata)是近年来我国新兴起栽培的一种珍稀食用菌品种，可在田间、林下、大棚等地进行栽培，其栽培模式主要以各种农林废弃物为原料，通过堆积发酵、铺料、播种进行栽培生产，岀菇后残余的大量栽培基质(菌渣)可以就地还田，有改良土壤的作用。本实验室前期研究表明大球盖菇在林地栽培出菇后，菌渣就地还田对林地土壤有较好的土壤改良效果[8]。然而菌渣还田对滨海盐碱土的影响研究尚未见相关报道。本试验拟通过探究 3 种不同含盐量滨海盐碱土区林地栽培大球盖菇出菇后，菌渣就地还田对盐碱土壤理化性质、养分含量以及真菌群落的影响，以期为大球盖菇在盐碱地的栽培及其菌渣还田改良盐碱地技术的推广提供理论参考。

　　1 材料与方法 1.1 试验地概况及材料

　　试验地位于山东省林业科学研究院东营分院(E118°41'33",N37°24'35")栽植的白蜡林下，树龄 6 年，株行距 3 m×4 m，郁闭度 0.7，土壤类型为中度～强度盐化土，为典型的滨海林地盐碱土(含盐量 2‰～6‰)，土壤性状背景值见表 1。当地年均气温 12.8℃，年均降水量 555.9 mm，年均日照时数 2 657.5 h。供试菌渣为 2018 年 10 月—2019 年 5 月在盐碱区林下栽培大球盖菇，出菇结束后剩余的栽培基质。基质配方为稻壳 45%、阔叶杂木屑 38%、玉米芯 10%、林地土 5%、生石灰 2%，666.7m2 栽培料施用量 6 500 ㎏。

　　1.2 试验设计及方法

　　2019 年 6 月 3 日出菇结束后，将原栽培大球盖菇的 3 块盐化程度不同的盐碱地上的菌渣，用旋耕机就地旋耕于地下，深度 20 cm，菌渣施入量(自然干重，含部分土壤)约 20 ㎏/m2。小区面积 30 m2，每处理重复 3 次，各重复地块之间相隔 5 m，对照组与处理组相隔 10 m，对照组只旋耕不添加菌渣。试验处理见表 2。

　　1.3 取样方法

　　菌渣施入土壤自然降解 4 个月后，用环刀法取土样用于测定土壤物理指标;通过“五点法”采集 0~20 cm 土层土壤，上下层土混匀，“四分法”留取土样，之后立即过 2 mm 网筛，装入已消毒的密封塑料袋中，液氮保存带回试验室，一半用于测定土壤微生物指标，一半风干用于测定土壤理化指标。

　　1.4 土壤理化性质的测定

　　土壤容重用环刀法测定，孔隙度(%)=(1-容重/土粒密度)×100，pH 值采用 pHS-2C 型数字酸度计测定，电导率(EC 5:1)采用 DDS-11A 型电导仪测定，土壤水稳团聚体采用湿筛法测定，有机质含量采用水合热重铬酸钾氧化-比色法测定，碱解氮采用扩散吸收法测定，有效磷采用 NaHCO3 浸提-钼锑抗比色法测定，土壤含盐量(‰)使用电导率法测定[9]。

　　1.5 土壤真菌高通量的测定

　　1.5.1 土壤微生物 DNA 提取、测序、处理 采用 CTAB 方法[10]对所采样本的基因组 DNA 进行提 取 。 以 稀 释 后 的 基 因 组 DNA 为 模 板 ， 使 用 带 Barcode 的 特 异 引 物 ITS5-1737F (GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG)/ITS2-2043R(GCTGCGTTCTTCATCGATGC)，以及高保真酶扩增 ITS1 区域。PCR 反应程序为：94℃预变性 5 min，94℃ 45 s，58℃ 45 s，72℃ 60 s，30 个循环，72℃延伸 7 min。 PCR 产物使用 2%琼脂糖凝胶进行电泳检测，对目的条带使用 Qiagen 公司提供的胶回收试剂盒回收产物。使用 TruSeq® DNA PCR-Free Sample Preparation Kit 建库试剂盒进行文库构建，文库经过 Qubit 和 Q-PCR 定量，使用 HiSeq2500 PE250 进行上机测序(北京诺禾致源生物信息科技有限公司)。根据 Barcode 序列和 PCR 扩增引物序列从下机数据中拆分出各样品数据，截去 Barcode 和引物序列后使用 FLASH 对每个样品的 reads 进行拼接，得到的拼接序列为原始 Tags 数据(Raw Tags);拼接得到的 Raw Tags，参照 Qiime 的 Tags 质量控制流程，经过严格的过滤处理得到高质量的 Tags 数据(Clean Tags)[11，12]。经过以上处理后得到的 Tags 序列通过 UCHIME Algorithm 与数据库 Gold database 进行比对，检测并去除其中的嵌合体序列，得到最终的有效数据(Effective Tags)[13，14]。

　　1.5.2 OTU 聚类和物种注释 利用 Uparse 软件[15]对所有样品的全部 Effective Tags 进行聚类，默认以 97%的一致性(Identity)将序列聚类成为 OTUs(Operational Taxonomic Units)，同时选取 OTUs 中出现频数最高的序列作为代表序列。用 SSUrRNA 数据库[16] 对代表序列进行物种注释，获得分类学信息并分别在各个分类水平统计各样本的群落组成。使用 PyNAST 软件[17]与 GreenGene 数据库中的 "Core Set" 数据信息进行快速多序列比对，得到所有 OTUs 代表序列的系统发生关系。最后以 reads 数最少的样品为标准对各样品的数据进行均一化处理，后续的 Alpha 多样性分析和 Beta 多样性分析都是基于均一化处理后的数据。

　　1.6 数据处理

　　土壤性质数据及微生物相对丰富度数据采用 Microsoft Excel 2010 进行处理和图表绘制;应用 IBM SPSS 21.0 中的 Duncan’s 法进行单因素方差分析。使用 Qiime 软件(Version 1.7.0)计算土壤 Observed-species、Shannon-Wiener index、Simpson index、Chao1 指数;使用 R 软件进行 Alpha Diversity、Beta Diversity 分析。

　　2 结果与分析 2.1 大球盖菇菌渣对盐碱土区林地土壤理化性质的影响

　　2.1.1 对土壤物理性质的影响 由表 3 看出，与对照组(CK)相比，施入大球盖菇菌渣的各处理土壤容重显著降低，土壤孔隙度、水稳性团聚体显著增加; M1s、Z1s、Z2s 处理土壤容重分别降低 34.07%、46.58%、48.48%，土壤孔隙度分别增加 28.78%、52.90%、52.50%，水稳性团聚体分别增加 58.54%、111.33%、123.82%。各处理组(S)间差异不显著，对照组(CK)间， M1ck 组的土壤容重、土壤孔隙度与 Z1ck、Z2ck 组间有显著差异，M1ck 组的水稳性团聚体与 Z2ck 组间有显著差异。结果表明，施入大球盖菇菌渣后改善了滨海盐碱土区林地的物理性质。

　　2.1.2 对土壤化学性质和养分的影响 由表 4 看出，与各对照组(CK)相比，施加大球盖菇菌渣的各处理组土壤 EC 值、含盐量均显著降低，土壤 EC 值分别降低 40.43%、83.03%、88.98%，含盐量分别降低 45.45%、85.34%、90.42%;各处理组间的 EC 值、含盐量差异不显著，各对照组间的差异显著。各处理组土壤有机质、速效磷、碱解氮均显著提高，土壤有机质分别提高 87.15%、 138.50%、238.90%，速效磷分别提高 401.33%、642.28%、965.80%，碱解氮分别提高 79.86%、179.57%、 269.89%。各处理组间有机质、速效磷、碱解氮差异不显著，各对照组间的差异显著(Z1ck 与 Z2ck 速效磷除外)。

　　2.2 大球盖菇菌渣对盐碱土区林地土壤真菌群落的影响

　　2.2.1 对土壤真菌的群落分布特征的影响 图 1 表明，各组得到有效序列(effective tags)均超过 55 000 个，OTUs 数目在 400～800 之间。各组真菌的相对丰富度在门水平上差异较大。与其他组相比，M1ck 组的球囊菌门 Glomeromycota(0.17%)，M1s 组的单毛壶菌门 Monoblepharomycota (0.04%)，Z1ck 组的优被孢霉门 Mortierellomycota(13.94%)、捕虫霉门 Zoopagomycota(0.002%)， Z1s 组的罗兹菌门 Rozellomycota(1.30%)、担子菌门 Basidiomycota(37.23%)、毛霉菌门 Mucoromycota(0.003%)，Z2ck 组的壶门菌 Chytridiomycota(1.57%)、芽枝霉门 Blastocladiomycota (5.19%)，Z2s组的梳霉门Kickxellomycota(0.002%)、新丽鞭毛菌门Neocallimastigomycota(0.003%)的相对丰富度最高。

　　如图 2 所示，除 Z1s 处理组外，各组的最优势真菌群落是子囊菌门 Ascomycota(>35%)， Z1s 处理组的最优势真菌群落担子菌门 Basidiomycota(37.23%);与各对照组(CK)相比，各处理组的子囊菌门 Ascomycota 相对丰富度菌以及 top10 真菌群落的相对丰富度之和均显著降低， M1s、Z1s、Z2s 处理组的子囊菌门 Ascomycota 的相对丰富度分别降低 33.87%、70.23%、29.18%， top10 真菌群落的相对丰富度之和分别降低 34.09%、27.06%、30.29%。结果表明，施加大球盖菇菌渣显著降低了滨海盐碱地的子囊菌门及 top10 真菌群落的相对丰富度。

　　2.2.2 对土壤功能真菌丰富度的影响 如表 5 所示，盐碱土区林地土壤中具有解磷功能的真菌有青霉属 Penicillium、曲霉属 Aspergillus、镰刀菌属 Fusarium，具有解钾功能的真菌有黑曲霉 Aspergillus niger，具有生防功能的真菌有木霉菌属 Trichoderma、节丛孢属 Arthrobotrys，林木病原真菌有尖孢镰刀菌 Fusarium oxysporum。与对照组相比，M1s 处理组的 Penicillium、Fusarium、 Aspergillus niger、Fusarium oxysporum 相对丰富度显著降低，Trichoderma、Arthrobotrys 相对丰富度显著增加，Z1s 处理组的 Aspergillus、Fusarium、Fusarium oxysporum 相对丰富度显著降低，Z2s 处理组的 Penicillium、Trichoderma 相对丰富度显著增加。结果表明，施入大球盖菇菌渣后，盐碱土区林地土壤功能真菌丰富度变化显著，中度盐化地(M1s)的木霉菌属、节丛孢属分别增加 604.11%、236.36%;强度盐化地(Z2s)的青霉属、木霉菌属分别增加 874.55%、218.10%，其原因同上述;中度盐化地(M1s)、强度盐化地(Z1s)的尖孢镰刀菌分别降低 80.43%、74.44%， Fusarium oxysporum 为林木病原菌，其减少后有利于树木健康生长。

　　2.2.3 对土壤真菌 Alpha 多样性的影响 如表 6 所示，与对照组(CK)相比，施入大球盖菇菌渣的 Z2s 处理组土壤真菌的物种数(Observed species)、丰富度指数(Chao1)、菌群多样性指数(Shannon-Wiener 与 Simpson)均显著增加，M1s、Z1s 处理组的各指标变化不显著(Z1s 处理的 Simpson 除外)。

　　2.2.4 对土壤真菌 Beta 多样性的影响 如图 3 所示，各处理组与各对照组在 MDS1 轴上明显分开。在 MDS2 轴上，3 个对照组也可明显分开，但是 3 个处理组聚集在一起。说明施入大球盖菇菌渣后，不同滨海盐碱土区林地的真菌群落结构(Beta 多样性)显著改变，且处理组的真菌群落分布特征趋于一致。

　　2.2.5 环境因子关联分析 由图 4 看出，X 轴(CCA1)为第一主成分;Y 轴(CCA2)为第二主成分;环境因子与处理组(M1s、Z1s、Z2s)的相关性大小排序为，孔隙度(porosity)>有机质(organic)>水稳性团聚体(aggregate)>pH 值>含盐量(salinity)，表明孔隙度是影响处理组土壤真菌群落结构差异的最大因素。含盐量、水稳性团聚体、有机质和孔隙度在 X 轴上的投影长度均明显大于在 Y 轴上的投影长度，表明这 4 个变量主要影响对照组和处理组之间的真菌群落构成。含盐量、pH 值、有机质、水稳性团聚体、孔隙度与真菌群落组成的相关系数和 P 值分别为(0.8970，0.0005)、(0.537，0.0070)、(0.9700，0.0005)、(0. 9214，0.0005)、(0.9532，0.0005)，均达到显著水平(P<0.05)。结果表明，滨海盐碱土区林地土壤含盐量、pH 值等理化性质与土壤真菌的群落结构显著相关。

　　3 讨论与结论

　　大球盖菇菌渣含有大量有机质和多种微生物及酶等其他活性物质，将其就地翻混于林地盐碱土 4 个月后，土壤容重降低 34.07%～48.48%，土壤孔隙度增加 28.78%～52.90%，水稳性团聚体增加 58.54%～123.82%，含盐量降低 45.45%～90.42%，有机质增加 87.15%～ 238.90%，速效磷增加 401.33%～965.80%，碱解氮增加 79.86%～269.89%。这与谢修鸿等[18] 关于姬松茸菌糠改良苏打盐碱土的研究，陈世昌等[19]关于平菇菌渣改良普通耕作土的研究，以及胡留杰等[20]关于杏鲍菇等其他菌渣改良普通耕作土的研究结果较为相似，不同之处为本研究是出菇后就地还田，不需要将菌渣粉碎和二次发酵，其改良成本低，改良效果更为显著。施加大球盖菇菌渣后，滨海盐碱土区林地土壤微生物中的子囊菌门 Ascomycota 及 top10真菌群落的相对丰富度显著降低;中度盐化地(M1s)的木霉菌属、节丛孢属分别增加 604.11%、236.36%;强度盐化地(Z2s)的青霉属、木霉菌属分别增加 874.55%、218.10%;中度盐化地(M1s)、强度盐化地(Z1s)的尖孢镰刀菌分别降低 80.43%、74.44%。这可能由于外源营养物质施入土壤后，为真菌微生物提供了大量的营养物质，从而改变真菌微生物的群落丰富度所致[21]。微生物群落结构可反映微生物竞争和协作等相互关系，群落结构影响微生物群落的功能和变化，从而导致土壤理化性质的改变[22,23]。本研究对滨海盐碱土壤真菌群落 Beta 多样性分析表明，菌渣对土壤真菌的群落结构改变显著。滨海盐碱地土壤微生物群落与环境因子的关联分析结果表明，土壤真菌的群落结构与土壤孔隙度、有机质等理化性质显著相关，这与陈莉莉等[24]关于土壤微生物群落与土壤理化性质的相关性结果较为一致。但本研究表明，盐碱土区林地土壤真菌微生物群落的丰富度变化幅度更大，分析原因为大球盖菇林地栽培特点是栽培基质数量大，菌渣还田 4 个月测量数据时，剩余的菌丝和菌渣还未完全降解，之后随着菌渣降解时间的延长，土壤群落丰富度变化趋势会相对稳定，本实验室前期研究已经得到验证[8]。

　　大球盖菇在林地栽培出菇后，出菇畦面上仍有约 20 kg/m2 的菌渣留在土壤中，菌渣剩余量大，就地翻混还田改良土壤成本低。本试验表明：滨海盐碱土施加大球盖菇菌渣后，土壤 EC 值、含盐量及土壤容重均显著降低;土壤孔隙度、有机质、速效磷、碱解氮含量均显著提高;土壤中子囊菌门 Ascomycota 及 top10 真菌群落的相对丰富度显著降低;强度盐化地(Z2s)土壤真菌群落丰富度显著提高，Alpha 多样性显著提高;盐碱地土壤真菌群落的 Beta 多样性显著改变;盐碱地理化性质与土壤真菌群落结构显著相关。本研究结果为滨海盐碱土的改良探讨了一条新的有效途径。