草莓脯贮藏期间非酶褐变的化学途径分析

　　摘 要：为确定贮藏期间草莓脯褐变的化学途径，将商业生产的同批次草莓脯分别于 37 ℃、25 ℃、4 ℃ 条件下贮藏，测定了色泽参数 L*、a*、b*以及抗坏血酸、总酚、3 种游离糖、5 种游离氨基酸和 5-羟甲基糠醛(5-HMF)含量，并进行了相关性和聚类分析。结果表明：随着贮藏时间延长，三个温度下 L*、a*、 b*均呈下降趋势，总色差△E 达 5.60 ~ 33.33, 说明色泽发生了显著变化;抗坏血酸、总酚、游离糖和氨基酸含量也出现不同程度的下降，其中抗坏血酸下降幅度最大;5-HMF 含量则呈线性上升。相关性分析显示除天冬酰胺外，其他色泽及化学指标与△E*均显著相关(P < 0.05)，说明色泽变化可能来自于抗坏血酸降解、多酚氧化和美拉德等途径的共同作用。聚类分析则将样品分为两类，较高温度、较长时间贮藏的样品与其他样品得以区分，说明温度与时间对褐变程度的影响不可忽略。总之，在草莓脯贮藏期间的褐变中，同时存在抗环血酸、酚类、糖和氨基酸参与的褐变反应，但各成分含量变化与褐变程度存在不同步性。结果将为草莓脯贮藏期间的褐变控制提供借鉴。

　　关键词：草莓脯;贮藏;非酶褐变;理化指标;相关性分析

　　牛丽影;胡丽丽;李大婧;刘春菊;张钟元 食品科学 2021-12-05

　　草莓脯是近年来的新兴果脯，但草莓脯贮藏过程中会发生褐变，影响其商品价值和产品形象。褐变是食品贮藏和加工中普遍存在的现象，可分为酶促褐变和非酶促褐变，加工后的食品则以非酶促褐变为主，非酶褐变的化学机制一般包括抗坏血酸降解，酚类物质的氧化聚集，美拉德反应，糖的裂解等，直接参与非酶褐变的化学成分往往包括抗坏血酸、还原糖、多酚、氨基酸等[1]。另外，5-羟甲基糠醛(5-HMF)作为非酶褐变的中间产物也一直广受关注，它来自于六碳糖的烯醇化、脱水、环化反应以及美拉德反应中的 amadori 重排[2, 3]。食品成分复杂，其非酶褐变往往为多种途径的共同作用，不同食品在不同的加工条件及贮藏环境下，造成褐变的主要途径和关键控制点不同，如 Paravisini 和 Peterson[4]认为美拉德反应是橙汁褐变的主要途径，关键成分有葡萄糖、色氨酸和谷氨酸;Wang 等[5] 则认为控制东北酸菜的褐变问题应抑制抗坏血酸氧化降解和多酚氧化聚合两个途径。

　　果脯为我国传统食品，通过糖渍干燥等工艺，使水果保存期延长。近年来，消费市场对果脯产品提出了低糖、无硫、天然色的健康营养新要求[6-8]，给果脯类食品的色泽控制技术带来新的挑战。但目前对果脯褐变的研究仍多为护色工艺优化[7, 8]，在机理与工艺结合角度仍待深入。果脯的种类很多，草莓脯作为新型果脯品类，仅有制作方法的介绍[9]，对其品质变化研究几乎空白。草莓鲜果含有丰富的抗坏血酸、多酚(花青素等)以及还原糖和氨基酸类[10,11]，这些成分均为褐变研究中广受关注的化学物质，但是这些成分在草莓脯中如何变化并在褐变中发挥什么作用尚未见报道。为探明草莓脯贮藏期间褐变的发生发展与温度、时间的关系以及内在化学成分变化机制，本文对不同温度贮藏期间草莓脯的色泽以及抗坏血酸、还原糖、多酚、氨基酸、5-HMF 含量变化进行了测定，对色泽及化学成分变化的关系进行了分析，并采用相关性分析和相似性聚类对关键途径进行了探讨。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料与试剂

　　市场采购同品牌同批次草莓脯，采用 9cm×13cm+3cm 规格磨砂(材料 BOPP+PET+PE)自封袋分装，每袋 15 颗草莓脯，密封后分别置于 37℃，25 ℃， 4℃保存，试验起始日期滞后生产日期 10 天。至设定贮藏日期取出草莓脯，剪碎后真空冻干，待分析用。色谱纯甲醇 德国 Merck 公司;色谱纯乙腈 美国 TEDIA 公司;氨基酸混合标样 美国 sigma 公司; 3-巯基丙酸、乙醇、偏磷酸、二水合磷酸二氢钠、四硼酸钠、邻苯二甲醛(OPA) 国药集团化学试剂有限公司。

　　1.2 仪器与设备

　　FD-1A-50 真空冻干机(上海比朗仪器有限公司);WSC-S 型色差仪(上海精密科学仪器有限公司);美国 Agilent 公司 1200 型高效液相色谱仪(配有二极管阵列及示差检测器);DNP-9052BS-Ш 电热恒温培养箱(上海新苗医疗器械制造有限公司);H3-16KR 台式高速冷冻离心机(湖南可成仪器设备有限公司);LBI-150 生化培养箱(上海龙跃仪器设备有限公司)。

　　1.3 方法

　　1.3.1 色差的测定

　　采用色差仪测定 L*、a*、b*值，每次测定 6 个草莓脯作为重复。另计算△E*表示总色差的大小，其计算公式为△E*=(△L* 2+△a* 2+△b* 2)1/2，其中△L*、△a*、△b*分别为测定值与初始值之间的差值。△E*越大，表明样品色泽与初始状态差别越大。

　　1.3.2 抗坏血酸的测定取 1.0 g 草莓脯样品于 10 mL 离心管中，加入少量预冷的 0.25% 的偏磷酸冰浴浸提，然后用 0.25% 的偏磷酸定容至 10 mL，在 4 ℃下 10, 000 r/min 离心 10 min，取上清液，上清液经 0.45µm 微孔滤膜过滤后待测。液相色谱测定条件：色谱柱为 ZORBAX 300SB-C18(4.6 mm×250 mm, 5μm)，流动相为 0.03 mol/L 正磷酸，流速为 0.8 mL/min，柱温 25℃，检测波长 240 nm，进样量 20 μL。

　　1.3.3 总酚的测定取 2.0 g 草莓脯样品，加 5.0 mL Folin - Ciocalteu 试剂混匀，静置 4 min 后加 4.0 mL 7.5 g/100mL 的 Na2CO3 溶液，室温避光放置 60 min 后，765 nm 处测定吸光值，以没食子酸做标准曲线，结果表示为每克冻干草莓脯含有没食子酸等效物质量( mg /g) 。

　　1.3.4 游离糖和游离氨基酸的测定样品处理：取草莓脯 1.0 g，加入 2 mL 蒸馏水进行研磨，用 5 mL 蒸馏水分三次冲洗研钵，将草莓脯浆液转移至容量瓶并定容至 10 mL，60 ℃超声处理 40 min。超声处理后混匀移 5.0 g 至 10 mL 离心管，4 ℃下 10,000 r/min 离心 10 min，取上清液用 0.45 µm 的微孔滤膜过滤后 -18 ℃冷冻保存，待液相色谱测定。游离糖的测定：色谱柱为 Carbohydrate 色谱柱( 150.0 mm × 4.6 mm，5 μm) ，检测器为示差(RID)检测器，流动相为乙腈:水(75:25, V/V)，柱温设为 30 ℃ ，进样量 20 μL，流速为 0.8 mL/min。游离氨基酸的测定：色谱柱为 ZORBAX Eclipse-AAA(4.6 mm×150 mm，3.5 μm)，检测器为二极管阵列(DAD)检测器。样品的 OPA 衍生及色谱条件参照文献[12]进行。定性定量方法：通过与糖及氨基酸标准样品比对进行定性，外标法定量。

　　1.3.5 HMF 含量的测定样品预处理：取 1.0 g 草莓脯，加 2.0 mL 甲醇水混合液(1:9, V/V)研磨，60 W 超声 30 min 后取出。于 4℃下 8000 r/min 离心 10 分钟，取上清液通过 0.45μm 的微孔滤膜，待液相色谱分析用。液相色谱测定条件：色谱柱为 ZORBAX 300SB-C18(4.6 mm×250 mm, 5μm)，流动相为甲醇：水(1 : 9, V/V)，柱温设为 35 ℃，进样量为 20 μL，流速为 0.8 mL/min。

　　1.4 数理统计采用 JMP 10.0 进行单因素方差分析、相关性分析与聚类分析。差异显著水平 P<0.05。相关性分析为 Pearson 相关，双向聚类采用标准化数据进行色图绘制和 ward 法聚类。

　　2 结果与分析 2.1 不同贮藏温度下草莓脯的色泽变化

　　色差计测定的表色参数中，L*为亮度值，其值越大表明表示物体亮度越高;a*为红值，a*>0 表示偏红，a*<0 表示偏绿;b*>0 表示偏黄，b*<0 表示偏蓝。由图 1 可以看出，草莓脯初始色泽中 L* 较高，a*、b*均为正值，总体呈现明亮的红色。食品贮藏中 L*下降表示亮度降低，往往表征样品存在褐变现象，但是不同食品褐变过程中三个参数的变化规律并不相同。在蜂蜜[13]、苹果酱[14]贮藏过程中褐变表现为 L*、b*下降但 a*值上升;荔枝的红色果皮贮藏 6 天中发生褐变，表现为 L*、a*、b* 全部下降 [15]。草莓脯贮藏过程中，L*、a*、b*值均呈下降趋势，并且温度越高变化越快，变化程度最大的 37 ℃下贮藏 90 天，L*、a*、b*值分别下降为初始值的 64.46%、17.95%和 21.07%。25 ℃和 4℃下变化较慢，即便延长贮藏至 150 天，参数值仍高于 37℃贮藏 90 天时，L*下降为初始值的 64.81% 和 74.37%，a*下降为初始值的 22.79%和 60.51%，b*下降为初始值的 37.22%和 35.53%。这种温度越高，变化越快的现象与蜂蜜、果汁等食品[13-15]一致。由以上数据还可以看出，三个参数对温度变化的敏感度不同，其中 a*对温度差异最为敏感即对于贮藏时间相同的样品，不同温度间差异最大。

　　另外，从总色差值△E*的变化来看，三个温度下△E*均随时间延长呈现上升趋势，△E*增加说明色泽变化越来越明显。相比初始值，37 ℃下贮藏 90 天时△E*达 33.33，25 ℃和 4 ℃下贮藏 150天时△E*分别为 30.51 和 20.99，均大于报道中贮藏后蜂蜜(△E< 7)[13]和苹果酱(△E< 20)[14]的总色差值，这说明草莓脯色泽在贮藏期发生了显著变化，也说明草莓脯贮藏期间的色泽控制是非常有必要的。

　　2.2 不同贮藏温度下草莓脯抗坏血酸及总酚含量变化

　　抗坏血酸和酚类物质是草莓中备受关注的具抗氧化功能的活性成分，其中抗坏血酸极易降解，往往作为食品新鲜度的标志性成分[16]。食品中抗坏血酸和总酚在贮藏期间含量往往会逐渐降低，并且温度越高降低越快[17-19]。由图 2 可以看出，草莓脯中抗坏血酸和总酚含量在贮藏初期迅速下降，随后下降速度减缓，并且贮藏温度越高，下降幅度越大，与以往对果蔬汁的研究一致[17-19]。草莓脯中抗坏血酸在 37 ℃、25 ℃和 4 ℃ 贮藏 90 天时分别降至初始值的 1.07%、16.16%、25.44%，总酚则分别下降至初始值的 25.61%、32.23%、39.18%，与橙汁[17-18]、西梅汁[19]和草莓汁[20]相比，草莓脯中抗坏血酸和总酚的损失率更高，虽然这种差异与包装等外界因素有关，但仍说明果脯作为一种有效延长水果食用期的加工产品，其贮藏过程中的营养成分损失是值得重视的。另据报道，果汁贮藏初期抗坏血酸和总酚下降速度最快与其中溶解氧的消耗有关，而后期降解则与包装材料的氧阻隔性有关[17,18]，因此，普通密封包装(未采取除氧措施)的草莓脯贮藏过程出现的这种抗坏血酸和总酚初期下降速度快，后期减缓的特点也有可能与包装中氧气的存在与消耗有关。在果汁生产往往通过脱气或充氮等方法来减少氧化作用，因此是否可以通过避免与氧的接触来控制草莓脯的褐变程度也是值得探讨的。

　　2.3 不同贮藏温度下草莓脯游离糖及氨基酸含量变化

　　草莓中的游离糖主要有果糖、葡萄糖和蔗糖[10, 21]，草莓脯中的糖也主要为这三种糖(表 1)。在贮藏过程中，三种糖随时间延长均表现为下降趋势，37 ℃和 25 ℃下贮藏初期迅速下降，30 天时果糖、葡萄糖和蔗糖三者含量为初始值的 25.18% ~ 59.01%，随后下降速度变缓，60 天时三种糖含量为 30 天的 83.67% ~ 96.37%。在 4 ℃下，三种糖的降解较慢，30 天时果糖与初始值无显著差异，葡萄糖和蔗糖含量则显著高于 37 ℃和 25 ℃下贮藏 30 天时含量值。不同温度下蔗糖含量在相同贮藏天数时均存在显著差异，表现为 37 ℃ < 25 ℃ < 4 ℃，说明温度越高，变化越快。但是，三个温度下果糖和葡萄糖的变化均出现了平台期，即 37 ℃下 30 ~ 75 天，25 ℃和 4 ℃下 90 ~ 120 天，同一温度下随时间延长差异不显著。果汁中果糖和葡萄糖含量在贮藏过程中往往变化不显著甚至含量上升，是因为蔗糖分解为果糖和葡萄糖，弥补了果糖和葡萄糖的损失[22]。本研究中草莓脯贮藏期间蔗糖呈下降趋势，但果糖和葡萄糖在初期的下降后，出现了一段平台期即在一定时间内含量变化差异不显著，而且贮藏温度越高，此平台期出现的越早，说明草莓脯贮藏过程中同样存在蔗糖降解为果糖和葡萄糖的过程，并且温度越高蔗糖降解速度越快，对果糖和葡萄糖含量的补充越快。总体而言，葡萄糖的损失最为严重，三个温度下至测试结束时含量为初始值的 5.68%~16.47%，而果糖为 17.74%~27.24%，蔗糖为 17.58%~23.12%。

　　游离氨基酸的降解在橙汁[4]、浓缩胡萝卜汁[23]、浓缩梨汁[24]等食品贮藏中均有报道，不同果汁中氨基酸总量损失可达 60%以上，但是对于单一氨基酸而言，不同氨基酸的变化规律不同。草莓脯中仅检测到 5 种游离氨基酸(表 1)，分别为天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、精氨酸、丙氨酸，与草莓鲜果氨基酸的组成[10]类似，五种氨基酸中含量最高的为天冬酰胺。由表 1 可看出不同温度下，氨基酸的变化趋势不同，37 ℃和 25 ℃下 5 种氨基酸含量随时间延长均表现出下降趋势，除天冬氨酸外， 37 ℃的下降幅度均大于 25 ℃。但是在 4 ℃贮藏时，5 种氨基酸则表现出先下降后上升的变化特点，尤其是天冬酰胺和丙氨酸甚至在贮藏 150 天时含量甚至高于初始水平。另外，5 种氨基酸中下降幅度最大的为谷氨酰胺，以 25 ℃贮藏为例，150 天时天冬氨酸、天冬酰胺、精氨酸、丙氨酸分别降至初始水平的 12.33%、23.3 4%、2.63%、34.40%，而谷氨酰胺仅为 1.53%。

　　食品中糖和氨基酸作为褐色成分的前体物，其含量变化一直广受关注。其中具有羰基结构的果糖、葡萄糖等还原糖和具有氨基结构的氨基酸等化学成分通过聚合、缩合等美拉德反应历程，可生成棕色甚至黑色大分子物质。据报道，影响甘蔗汁色值的首要因素为果糖，其次为赖氨酸[25];橙汁贮藏中发生褐变，葡萄糖、谷氨酰胺和色氨酸可能发挥了重要作用[4]。贮藏期间草莓脯的游离糖中以葡萄糖降幅最大，氨基酸中则以谷氨酰胺含量下降幅度最大，这种变化与橙汁[4]类似，这是否预示草莓脯的褐变机理与橙汁相似仍待深入验证。

　　2.4 不同贮藏温度下 5-HMF 含量变化

　　5-羟甲基糠醛(5-HMF)是葡萄糖或果糖在酸性条件下脱水分解产物，是美拉德反应、焦糖化反应及抗坏血酸氧化分解反应共同的中间产物，可参与美拉德反应的后阶段生成褐色物质[3-5]。5-HMF 往往与食品褐变程度显著相关，并作为预测褐变速度的指标[26]。如图 3 所示，草莓脯贮藏过程中 5-HMF 含量三个温度下均呈线性增加，温度越高增加越快，37 ℃下增长速度分别为 25 ℃和 4 ℃的 26.91 倍和 293.76 倍。不同温度下 HMF 的生成速度差别如此之大说明控制温度在控制草莓脯褐变中非常重要，这与在甘蔗汁美拉德褐变研究中认为温度是影响最大的因素一致[25]。但由于 5-HMF 具有多种前体物及形成途径，因此探究草莓脯贮藏过程中 5-HMF 形成的主要途径对于控制其褐变具有重要意义。

　　2.5 色泽变化与化学指标的相关性

　　为更好的发现色泽变化与化学指标的关系，进行了相关性分析。图 4 为色泽、抗坏血酸和总酚含量、游离糖和氨基酸、5-HMF 各项理化指标相关性系数 r 的聚类色图。由图中可以看出，色泽参数 L*、a*、b*、△E*两两之间显著相关(P < 0.01)，说明几个参数在表征色泽变化时具有一致性，其中△E*与三个色泽参数之间的相关性均达到极显著水平(P < 0.001)。以△E*来表征总色泽变化，发现与其显著相关的化学指标有抗坏血酸和蔗糖(P < 0.001)，其次为多酚、5-HMF 和葡萄糖(P < 0.01)，然后为天冬氨酸、果糖、精氨酸、丙氨酸和天冬酰胺(P < 0.05)。也就是测定的 11 个化学指标中仅与谷氨酰胺的相关性不显著。但是，谷氨酰胺与 L*、多酚和抗坏血酸显著相关(P < 0.05)。据报道 [27]，抗坏血酸的降解可分为有氧降解与无氧降解，其无氧降解主要经过水解、脱羧、脱水和成环等步骤生成二羰基化合物，可与氨基酸发生羰氨缩合等反应生成有色物质;在有氧条件下则裂解为高反应活性的小分子化合物，可与其他成分进一步反应生成褐色大分子化合物。抗坏血酸是草莓脯贮藏过程中变化最快的成分，与 3 个色泽参数、3 个游离糖、3 个氨基酸(天冬氨酸、谷氨酰胺、精氨酸)、 5-HMF 均表现出显著的相关性(P < 0.05)，说明其与褐变反应密切相关，可能发生了有氧降解、无氧降解以及与氨基酸的羰氨缩合等多途径反应。3 个游离糖与 3 个色泽参数、抗坏血酸、总酚两两间表现为显著相关(P < 0.05)，但与除天冬氨酸外的其他 4 个氨基酸和 5-HMF 相关性不显著，说明还原糖参与的美拉德反应造成的褐变与整体色泽变化存在不一致性。总体而言，根据色泽指标与各成分间的相关性，可以认为抗坏血酸、酚类物质、糖及氨基酸均参与了草莓脯褐色物质的生成，但不同反应途径具有不同步性。

　　对测定的指标和样品双向聚类的结果如图 5。三个温度下不同贮藏期的 15 个样品聚为两类：4 ℃ 下贮藏的 5 个样品、25 ℃下贮藏时间较短(30 ~ 90 天)的 3 个样品与 37 ℃下贮藏 15 天及 30 天的 2 个样品聚为类别 I;其他 5 个样品聚为类别 II。所有指标可以分为 4 组：1)L*、抗坏血酸、总酚、 b*、谷氨酰胺;2)a*、天冬氨酸、果糖、蔗糖、葡萄糖;3)天冬酰胺、精氨酸、丙氨酸;4)△E*与 5-HMF。两种类别的主要区别在于类别 I 中的样品第 1~3 组指标值较高(红-黑色为主)，△E*与 5-HMF 作为第 4)组指标红色区域仅分布于 37 ℃下贮藏 60 ~ 90 天的 3 个样品与 25℃下贮藏 120 天及 150 天的样品中，体现了 5-HMF 含量变化与整体色泽变化具有一定的同步性，并具有温度敏感性。 5-HMF 的这种变化特点说明其含量的增加可能来自于几种不同褐变途径的叠加。

　　3 结论与讨论

　　本文通过对不同温度下草莓脯贮藏过程中色泽变化和成分变化的研究，发现随贮藏时间延长， 37 ℃、25 ℃、4 ℃下草莓脯 L*、a*、b*值均呈下降趋势，5-HMF 则线性上升，说明草莓脯贮藏过程中存在明显的褐变现象。果糖、葡萄糖和蔗糖三种游离糖中蔗糖随时间延长呈下降趋势，而果糖和葡萄糖则出现了平台期，说明可能存在蔗糖分解为果糖和葡萄糖的反应。五种氨基酸在 37 ℃和 25 ℃ 贮藏呈下降趋势，但在 4 ℃时则先下降后上升，说明温度对氨基酸与糖的美拉德反应途径影响较大。总之，色泽参数与 5-HMF 的线性变化可能是抗坏血酸和酚类的氧化反应以及美拉德反应等褐变途径的综合作用。

　　食品贮藏过程中广泛存在非酶褐变，但相关化学成分的变化趋势与主要途径因食品特点而异。柑橘汁在贮藏过程中抗坏血酸呈直线下降，与褐变显著相关，因此抗坏血酸的降解被认为是褐变的主要途径[28]。草莓脯中抗坏血酸和酚类氧化可造成褐变，另外果糖、葡萄糖、天冬氨酸等做为美拉德反应的主要组分也呈现下降趋势，因此可以判断在草莓脯贮藏褐变中，同时存在氧化褐变和美拉德褐变两种途径。较高温度下贮藏时间较长的样品通过聚类分析与其他样品得以区分，说明温度和时间为影响褐变程度的重要外界因素。抗坏血酸和多酚与草莓清除自由基和抗氧化能力等营养特性显著相关[29]，而糖与氨基酸又是重要的风味成分[30]，这些成分的降解不仅导致褐变，还会降低草莓脯的营养风味品质，因此如何针对性地采取措施，如抗氧化处理与包装方式改进，将对草莓脯的品质提高及产业升级具有重要意义。