丁氟螨酯在蚯蚓体内的富集及其急性毒性
摘 要：丁氟螨酯(CYF)对土壤中非靶标动物蚯蚓的影响尚未明确。本研究建立了丁氟螨酯在蚯蚓体内的检测方法。样品经乙腈提取，采用液液萃取法去除蚯蚓体内的油脂，利用正相液相色谱(NP-HPLC)进行检测。结果表明：在 0.5、5 和 10 mg/kg 3 个添加水平下，CYF 在蚯蚓中的回收率在 84%~88%之间，相对标准偏差在 1.3%~3.1%之间，上述结果验证了该提取方法的可靠性。生物-土壤富集因子(BSAF)表明，蚯蚓富集 CYF 7d 后两个对映体在蚯蚓体内的富集浓度达到最大值，且(+)-CYF 的富集能力显著高于(-)-CYF 的。蚯蚓在 0.5~10 mg/kg CYF 的土壤中暴露 28d 时会严重抑制其体重。通过滤纸法检测到 CYF 对蚯蚓的急性毒性，CYF 消旋体对蚯蚓的 LC50 值为 162.5 mg/L，(-)-CYF 对蚯蚓的 LC50 值为 323.1 mg/L，(+)-CYF 对蚯蚓的 LC50 值为 309.4 mg/L。根据联合毒性效应分析得到 AI=-0.03，同时使用 CYF 的两个对映体会对蚯蚓造成毒性相加作用。
石琳琳; 杨灿灿; 陈琪; 徐军; 张平; 何林， 农药学学报 发表时间：2021-09-26
关键词：丁氟螨酯;蚯蚓;生物-土壤富集因子;体重;急性毒性
丁氟螨酯(CYF)是一种使用广泛的新型手性高效杀螨剂，它可以有效防控红蜘蛛的各个生长阶段，已经在全世界范围内商业化并用于多种农作物[1]。目前，关于丁氟螨酯的研究主要集中在土壤中的降解和代谢途径的建立以及对靶标生物的毒理学方面[2]。大量研究结果表明，丁氟螨酯在环境和细胞中存在一定的风险性[2]。不合理使用会造成土壤中 CYF 的沉积量不断增加。农药对土壤环境影响的评估，主要通过对土壤系统中微生物的影响以及对土壤中非靶标生物的毒性研究进行。据报道，丁氟螨酯对映体会影响土壤微生物的结构，甚至会破坏原有的土壤氮循环功能，最终对生态环境造成负面影响[3]。而丁氟螨酯在土壤中对非靶标生物的毒理学研究未见文献报道。
蚯蚓作为土壤中的主要非靶标动物对土壤富集营养和对有机物、无机物的分解有着极其重要的作用[4]。蚯蚓可以分解土壤中死去的有机物，同时也是许多物种的重要食物来源[5]。由于蚯蚓对农药的刺激十分敏感，通常被作为土壤污染的最为敏感的生物标志物[6]。鉴于此，本研究通过丁氟螨酯在蚯蚓体内富集能力以及对其体重的影响，来评估其环境风险，以期为更好地评价新型乙腈类杀螨剂-丁氟螨酯提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 供试材料与仪器
98%丁氟螨酯消旋体(Rac-CYF)购于北京华威锐科公司，(-)-CYF 和(+)-CYF 于本实验室分离得到，纯度亦均为 98%。分析纯乙醇、正己烷、异丙醇、1%乙酸、丙酮、无水硫酸钠和氯化钠购于 Amida Chemical Co.，Ltd;0.22 μm 滤膜购于西南大学文化用品百货公司。其他试剂均为分析纯或 HPLC 级。供试蚯蚓为赤子爱胜(Eisenia fetida)购于青岛瓦力生物科技有限公司。蚯蚓暴露在土壤之前，于(20±2)℃、相对湿度 80%条件下适应环境 2 周。挑选体重[(0.4±0.02)g]均匀的带有生殖环的蚯蚓，置于滤纸上进行 12h 的清肠处理。试验用土为人工土，由 70%沙土、20%高岭土和 10%泥炭藓(质量分数)组成，用碳酸钙调整 pH 值为 6.0±0.5，完全符合经合组织(OECD)人工土配制标准[7]。
Shimadzu LC-20AD 正相液相色谱仪(日本 Shimadzu 公司);高速组织捣碎机(上海齐欣科学仪器有限公司);ZWY-240 恒温培养振荡器(上海智诚分析仪器制造有限公司);RE52AA 旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器公司);3-5N 台式低速离心机(湖南恒诺仪器设备有限公司)。
1.2 丁氟螨酯对映体在蚯蚓体内富集情况检测
向已配制好的人工土中添加 CYF，添加水平为 10 mg/kg 的 CYF 外消旋，其两个等量对映体的浓度为 5 mg/kg，将蚯蚓暴露于污染土壤中。分别于处理后 2、4、7、9、12、14 和 21d 取样检测对映体在蚯蚓体内富集情况。按公式(1)计算生物-土壤富集因子[8]。 BSAF =ce/cs (1)式中，BSAF 为蚯蚓从土壤中富集污染物的能力;ce 为蚯蚓体内对映体浓度;cs 为土壤中对映体浓度。
1.3 蚯蚓中丁氟螨酯的提取及检测
丁氟螨酯在蚯蚓中的提取，以乙腈为提取溶液，使用 Shimadzu LC-20AD 的 NP-HPLC 进行检测。取已染毒的蚯蚓 5 g，过夜吐泥后，放入 50 mL 离心管中，加入 25 mL 乙腈，用高速组织捣碎机匀浆 30 s;加入 2 g 氯化钠、2 g 硫酸钠和 10 mL 去离子水，于 300 r/min 下振荡 30 min 后，于 4500 r/min 下离心 15 min;取上清液，过无水硫酸钠后转移至梨形蒸发瓶，反复进行 3 次提取;收集全部提取液，旋转蒸发至 1 mL，加入 1 mL 正己烷进行分层萃取。同样步骤进行 3 次;取上清液，于 40℃下旋转蒸发至近干，用正己烷定容至 1 mL，过 0.22 μm 滤膜，待 NP-HPLC 测定。
检测对映体拆分的手性分离柱选用 AY-H 柱，流动相 V(正己烷)：V(异丙醇)=97:3 溶液，柱流量为 0.8 mL/min，进样量为 10 μL。每个样品 3 次重复。
1.4 添加回收试验
向蚯蚓空白样品中准确添加 0.5、5 和 10 mg/kg 3 个水平的丁氟螨酯标准溶液，每个水平重复 5 次。采用 1.3 节方法进行样品前处理，采用 NP-HPLC 系统进行检测，计算平均添加回收率和相对标准偏差(RSD)。根据一级反应动力学拟合效果、添加回收率、检出限来验证该方法的可行性[3]。
1.5 对 CYF 暴露的蚯蚓体重检测
挑选体重为(0.5±0.1)g 的蚯蚓，分别放入 CYF 质量浓度为 0.5、5 和 10 mg/L 的人工土壤中，记录各浓度暴露下蚯蚓的体重变化。选择 7 条蚯蚓记录其初始体重 W0，分别在暴露 4、7、14、21 和 28d 后记录蚯蚓体重为 Wd，根据公式(2)计算体重的变化率 R。暴露结束后，用 1mm 网筛筛分培养的土壤，收集蚯蚓茧和蚯蚓幼体。每个处理重复 3 次。 R/%=(Wd-W0)/W0×100 (2)
1.6 急性毒性试验
采用滤纸法和人工土壤法两种方法进行。
1.6.1 滤纸法
根据 OECD 标准[7]，在直径 3 cm、高 8 cm 的圆底玻璃管中，铺好滤纸以确保没有重叠，分别加入 1 mL 用正己烷配制的浓度分别为 50、100、150、200、300、500、700 和 1000 mg/L 的丁氟螨酯消旋体和对映体标准溶液，待正己烷完全挥发后，用 1 mL 无菌水均匀润湿滤纸，放入一条已清肠的蚯蚓，确保蚯蚓可以接触到湿润的滤纸，每组 10 次重复。另以只加 1 mL 正己烷和 1 mL 水为空白对照。将玻璃管封口并保持透气，于 18℃、相对湿度 80%条件下培养 48 h，观察死亡情况。
根据 Marking 相加指数法[8]按公式(3)~(5)评价两个对映体对蚯蚓的复合毒性。 s =