LmNotch基因在飞蝗翅发育中的功能分析

　　摘要：Notch 是 Notch 信号通路中的受体蛋白，与配体结合后调控下游靶标基因的表达，在无脊椎动物和脊椎动物的发育和分化过程中发挥着重要的作用。本文以飞蝗为研究对象，利用转录组数据库搜索获得 Notch 信号通路受体基因 LmNotch，并利用 qRT-PCR 对 5 龄飞蝗不同组织及不同发育时期翅芽组织中的 LmNotch 表达特性进行了分析。通过 RNA 干扰试验对其生物学功能进行分析，发现注射 dsLmNotch 的飞蝗有 70%无法完成蜕皮过程，10%的飞蝗在蜕皮后出现翅紊乱表型。飞蝗翅芽石蜡切片的 H&E 染色结果表明，处理组翅上下两层表皮之间腔空间增大，新表皮无法完整形成。qRT-PCR 检测其他翅发育相关基因表达发现， LmNotch 表达量的下降影响翅发育相关基因 Dpp、Omb、Yorkie 以及翅特异表皮蛋白基因的表达。上述研究结果可为昆虫翅发育机制研究提供理论基础，同时为害虫生物防治提供潜在靶标。

　　徐子龙; 张福斌; 武兆辰; 张晶; 张建珍; 赵小明， 中国生物防治学报 发表时间：2021-09-16

　　关 键 词：飞蝗;RNA 干扰;翅发育;Notch

　　昆虫是世界上数量最多、种类最大的生物类群，也是唯一一种进化出了飞行能力的无脊椎动物。翅在昆虫迁飞、求偶、觅食和躲避敌害等方面具有重要作用[1]。昆虫的翅是由外胚层发育而来，完全变态昆虫是由保留在幼虫体内的器官芽经过完全变态发育成为完整的翅，如黑腹果蝇 Drosophila melanogaster 等;渐变态昆虫则由若虫的“翅芽”经过不完全变态发育成为完整的翅，如飞蝗 Locusta migratoria 等[2]。因此，对昆虫翅发育过程的研究将有助于了解昆虫的变态。昆虫翅发育的控制是一个非常精确和复杂的过程。目前，对昆虫翅发育机制的研究主要来自黑腹果蝇[3]。在果蝇中，翅的发育受到 Decapentaplegic(Dpp)、Wingless (Wg)、Hedgehog(Hh)、Hippo、Notch 以及 JNK 等信号通路的调控[4-6]，而且在许多不同的动物中，这些信号通路在进化上是高度保守的。目前，在很多模式昆虫中这些信号通路中的一些影响翅发育的关键基因已被鉴定出来，如黑腹果蝇和赤拟谷盗 Tribolium castaneum 等[7-10]。

　　Notch 信号通路在动物中是高度保守的，在细胞发育过程中控制细胞命运，并维持成体组织的稳态[11,12]。Notch 信号通路主要由 Notch 受体、Notch 配体(Delta(Dl)，Serrate(Ser))、 CSL(C promoter binding factor-1 (CBF1), Suppressor of hairless (Su(H)), Lag-1)转录因子、其他效应子与 Notch 调节分子构成[13]。其激活依赖于一个细胞膜上的配体与相邻细胞的 Notch 受体结合，这种结合使得 Notch 的胞内结构域 NICD(intracellular domain of Notch)的释放，之后进入细胞核内与转录因子 CSL 结合，调控其下游的基因表达[14,15]。Notch 是一个 300 kDa 的单次跨膜蛋白，由一个大的胞外区域、一个单一的跨膜部分和一个小的胞内区域组成[16]，其中胞外结构域由多个数量不同的 EGF(epidermal growth factor)重复单元、3 个 Lin12/Notch repeats(LNRs)和一个邻近跨膜结构域组成，胞内结构域包括一个 RAM(recombinationbinding protein-J–associated molecule)区域、7 个锚蛋白重复结构域(Ankyrin)、一个反激活区域(transactivation domain (TAD))和一个 C 末端区域[11]。在昆虫翅发育研究中，Notch 信号通路直接参与果蝇背部翅原基边界的形成以及翅细胞的增殖分化[17]。然而，在非模式昆虫中翅发育相关基因的鉴定及功能仍不清楚。

　　飞蝗是一种典型的渐变态昆虫，也是世界性农业害虫。本文以 Notch 信号通路受体为研究对象，探讨其在飞蝗翅发育中的功能，以期为渐变态昆虫翅发育机制研究提供理论依据，同时为蝗虫防治寻找新分子靶标，从而为蝗灾生物防治提供基础资料。

　　1 材料与方法

　　1.1 试验材料

　　试验所用飞蝗虫卵保存于本实验室的昆虫饲养室，于人工孵化箱中孵化后移至干净的纱笼中，每天喂食新鲜的小麦幼苗(3 龄后辅以麦麸)，待其生长至 5 龄后进行试验。培养温度为(30±2)℃，湿度为(40±10)%。

　　1.2 相关试剂

　　RNA 提取试剂(RNAiso Plus)购于大连宝生物公司(TaKaRa);双链 RNA 合成试剂盒购于 Promega 公司;胶回收试剂盒购于天根公司(TIANGEN);HiScriptⓇⅢ RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)，ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 购于南京诺唯赞生物科技有限公司。

　　1.3 cDNA 序列获取及聚类分析

　　基于飞蝗转录组和基因组数据库，搜索得到 LmNotch 基因的 cDNA 序列。将其 cDNA 序列翻译成氨基酸序列，并对其编码蛋白的功能域进行分析。下载人 Homo sapiens、小鼠 Mus musculus、黑腹果蝇 D. melanogaster、亚洲玉米螟 Ostrinia furnacalis、棉铃虫 Helicoverpa armigera、赤拟谷盗 T. castaneum、德国小蠊 Blattella germanica 等物种的 Notch 氨基酸序列，利用 MEGA 6.0 软件的 Neighbor-Joining 方法构建系统进化树，独立分析 1000 次，数值代表 bootstrap 估算值。

　　1.4 总 RNA 的提取及表达特性分析

　　摘取 5 龄飞蝗第 1～8 d(N5D1-N5D8)的翅芽(WP)组织，同时取 5 龄第 6 d 的若虫各个组织包括足(LG)、体壁(IN)、翅芽(WP)、脂肪体(FB)、前肠(FG)、中肠(MG)、后肠(HG)、胃盲囊(GC)、精巢(TE)、卵巢(OV)。利用 RNAiso Plus 提取总 RNA，最终定量至 0.5 μg/μL。根据反转录说明书进行反转录，得到 cDNA。通过 Primer Premier 5.0 软件设计 LmNotch 基因的特异性荧光定量引物(表 1，由生工公司合成)，以 RPL-32 为内参基因，利用 qRT-PCR 的方法检测 LmNotch 的时期和组织表达情况，设置 4 次重复试验，结果用 2 -ΔΔCt 法进行分析[18]。

　　1.5 RNA 干扰和 H&E 染色

　　根据 LmNotch 的 cDNA 序列设计并合成带有 T7 启动子序列的特异性引物(表 1，由生工公司合成)，以 5 龄若虫翅芽 cDNA 为模板进行 PCR 扩增，扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳检测纯度后利用胶回收试剂盒进行胶纯化。以 1 μg 胶回收产物为模板利用 dsRNA 合成试剂盒合成 LmNotch 基因的 dsRNA(dsLmNotch)，将产物进行琼脂糖凝胶电泳检测为单一条带后定量至 2 μg/μL。选取 24 h 内的 5 龄第 1 d 的飞蝗，对其注射 dsLmNotch(注射数量为 42 只)，每只的注射剂量为 10 μg，同时注射等量的 dsGFP(共 47 只)作为对照。取 5 龄第 6 d(N5D6)的飞蝗翅芽组织，一部分用于沉默效率检测，检测时取 6 组重复，每组设 2 次技术重复，另一部分用 3%戊二醛进行固定。同时摘取对照组和处理组蜕皮前(N5D7)的翅芽，用 3%戊二醛固定，随后送往武汉塞维尔生物科技有限公司进行石蜡切片和 H&E(伊红和苏木精)染色。剩余虫子正常饲养进行表型观察。

　　1.6 LmNotch 对其他翅发育相关基因表达的影响

　　利用课题组飞蝗转录组数据库，识别翅发育相关基因包括 Dpp、Omb(optomotor-blind)、 Salm(spalt major)、Salr(spalt related)、Yorkie 以及翅特异表皮蛋白基因 LmACP7、LmACP8、 LmACP19。分别以 RNA 干扰的处理组和对照组个体翅芽组织 cDNA 为模板，利用 qRT-PCR 检测其他翅发育相关基因的表达，检测引物见表 1(由生工公司合成)。

　　1.7 数据统计与分析

　　采用 2 -ΔΔCt 法对 LmNotch 基因在不同发育天数和不同组织中的相对表达量、RNA 干扰后 LmNotch 沉默效率、以及沉默 LmNotch 后翅发育相关基因的相对表达量进行分析，采用 Student t-test 方法进行差异表达分析(*P<0.05表示差异显著，** P<0.01表示差异极显著)。

　　2 结果与分析

　　2.1 LmNotch 功能域及聚类分析

　　根据飞蝗转录组和基因组数据库，搜索获得 LmNotch 基因 cDNA 序列，该基因含有 7455 bp 开放阅读框，编码 2484 个氨基酸。通过对 LmNotch 基因编码蛋白进行结构分析发现其含有 36 个 EGF(epidermal growth factor)重复单元、3 个 NL(Lin-12/Notch)结构域、1 个NOD(NOTCH protein domain)结构域、1 个 NODP 结构域、7 个 ANK(Ankyrin repeats)结构域和 1 个 DUF3454(Domain of unknown function)区域(图 1A)。聚类分析显示，Notch 在物种间保守性较高，且 LmNotch 与蜚蠊目 Notch 聚为一支(图 1B)。

　　2.2 LmNotch 在 5 龄飞蝗中的表达特性

　　利用 qRT-PCR 进行 LmNotch 的表达特性检测，结果显示 LmNotch 在 5 龄若虫翅芽发育第 1～4 d 的表达量较高(N5D1～N5D4)，而在第 5～8 d 表达量较低(N5D5～N5D8)(图 2A);LmNotch 在足、翅芽、前肠和卵巢中有较高表达，而在其他组织中表达量相对较低(图 2B)。

　　2.3 LmNotch 生物学功能分析

　　对 5 龄第 2 d 的飞蝗注射 dsLmNotch，以注射等量 dsGFP 的飞蝗为对照，取翅芽检测沉默效率。结果显示，相对于对照组，处理组中 LmNotch 表达极显著降低(图 3A)。表型观察结果显示，对照组飞蝗均能蜕皮至成虫，而注射 dsLmNotch 的飞蝗约 70%无法完成蜕皮过程产生致死表型，另有 10%的飞蝗能够蜕至成虫但出现翅紊乱表型(图 3B，3C)。分别对 N5D6 和 N5D7 的对照组和处理组飞蝗翅芽进行石蜡切片和 H&E 染色分析，结果显示，对照组中 N5D6 和 N5D7 翅芽旧表皮发生降解，形成大量新表皮并产生折叠，上下两层新表皮间形成空腔，而处理组中翅芽旧表皮虽能够正常降解但翅上下两层表皮之间腔空间增大，新表皮无法完整形成(图 4)。

　　2.4 LmNotch 影响翅发育相关基因的表达

　　利用 qRT-PCR 检测沉默 LmNotch 的表达后翅发育相关基因及翅特异表皮蛋白基因的表达，结果显示 Dpp、Omb、LmACP7 和 LmACP8 基因的表达量显著降低，而 Yorkie 和 LmACP19 的表达量显著升高(图 5)。

　　3 讨论

　　本文基于飞蝗翅转录组数据库，获得了 Notch 信号通路中关键受体因子 Notch。与其他物种 Notch 类似，飞蝗 Notch 含有 EGF 重复单元、Lin-12/Notch 结构域、NOD/NODP 结构域和 ANK 结构域，且该蛋白在物种间高度保守(图 1)，暗示其可能具有保守性功能。已有研究表明 Notch 在生物体的生长发育、器官形成中的细胞分化增殖和凋亡具有重要作用 [19]。如果蝇中，Notch 的重复单元 EGF-23 到 EGF-29 发生单个氨基酸替换时，导致果蝇 Notch 信号的异常从而发生表型变化[20]。在哺乳动物中，研究表明 Notch 信号通路对哺乳动物的神经系统和生殖系统等发育具有重要作用[21]。

　　在无脊椎动物中，昆虫是唯一有翅的生物类群。昆虫翅的发育受到一系列信号通路的控制，如 Hippo，Wingless，Dpp 和 Notch 等信号通路。在家蚕 Bombyx mori 中，干扰 Hippo 信号通路中转录共激活因子 BmYorkie3 的表达能够抑制翅生长发育[22]。Dpp 信号通路靶基因 Sal(Salm 和 Salr)是飞蝗和果蝇翅生长发育所必需的[23]。在飞蝗中，LmNotch 在翅芽组织中高表达(图 2)，可能参与飞蝗翅的发育。利用飞蝗对 RNA 干扰的敏感性，合成并向 5 龄若虫注射 LmNotch 基因 dsRNA，结果显示 LmNotch 沉默效率达到 90%以上，且沉默 LmNotch 的飞蝗个体出现蜕皮困难和翅紊乱的表型(图 3)，表明 LmNotch 在飞蝗蜕皮和翅发育中发挥了重要作用，但 LmNotch 如何影响飞蝗蜕皮和翅发育尚不清楚。据报道，Notch 受体与配体 Delta (Dl)和/或 Serrate 结合后，会经历一系列的蛋白水解，从而产生 Notch 胞内结构域(Notch intracellular domain，NICD)[24]。NICD 转移到细胞核中，与转录因子 Hairless和协同激活因子 Mastermind 结合，刺激下游靶基因的表达[25]。为了探讨 LmNotch 在飞蝗翅发育中的下游靶基因，作者根据果蝇翅发育相关基因序列(Dpp，Omb，Salm，Salr 和 Yorkie)搜索获得了飞蝗同源基因序列并检测了沉默 LmNotch 表达后翅发育相关基因的表达变化。结果发现，沉默 LmNotch 表达后 Dpp 和 Omb 表达显著下降，Yorkie 表达显著上升，而 Salm 和 Salr 没有显著变化(图 5)。2014 年，Djiane 等[26]研究发现 Notch 能够抑制果蝇翅原基中 Yorkie 的活性，这与本试验结果一致。同样在果蝇翅发育研究中，Dpp 对其下游基因 omb 起正调节的作用[27]，而在飞蝗中沉默 LmNotch 表达后能够降低 Dpp 和 Omb 的表达。上述结果表明，LmNotch 能够调控 Hippo 和 Dpp 信号通路中关键基因的表达进而影响翅的发育。

　　昆虫翅的发育除了受一系列复杂的基因控制外，还依赖于细胞的一系列功能和细胞外基质。本课题组前期研究中发现飞蝗翅特异表皮蛋白基因(LmACP7，LmACP8 和 LmACP19)在翅表皮细胞外基质形成和稳定性方面发挥重要作用，这些基因的缺失可导致飞蝗翅发育异常[28-30]。本文研究发现，沉默 LmNotch 表达后能够显著抑制 LmACP7 和 LmACP8 的表达，而促进 LmACP19 的表达(图 5)，这可能是导致翅表皮形成异常的原因之一(图 4)，这些结果暗示 LmNotch 可能通过调控翅表皮蛋白基因的表达参与飞蝗翅表皮细胞外基质的形成，然而其具体作用机制如何，还需要进一步研究。