白桦BpSPL6基因启动子的克隆及表达分析

　　摘要:【目的】SPL 是植物特有的转录因子，参与植物幼年期向成年期的转变、营养生长向生殖生长的转变、花发育、孢子发生、叶片和根发育、逆境响应等多个过程，在植物的生长发育过程中起着非常重要的作用。探究白桦中 BpSPL6 基因启动子区的顺式作用元件，以及该启动子在正常和胁迫条件下的表达模式，可为进一步研究 BpSPL6 基因的功能提供参考，也可为了解白桦的抗逆机制提供依据。【方法】以本实验室组培白桦的总 DNA 为模板，经 PCR 克隆了 BpSPL6 基因上游 1 703 bp 的启动子序列，用 PLACE 和 Plant CARE 在线软件分析启动子区的顺式作用元件。构建了 BpSPL6 基因启动子驱动 GUS 报告基因的植物表达载体并转化拟南芥，探究其组织表达特性和胁迫条件下的表达模式。【结果】PCR 成功克隆了 BpSPL6 基因上游 1 703 bp 的启动子序列，对启动子区的顺式作用元件预测发现除了含有核心启动元件 TATA-box、 CAAT-box 外，还包括 2 种特异组织表达元件(根、花粉)，10 种激素响应元件(生长素、赤霉素、水杨酸、脱落酸)，4 种脱水响应元件等。对转基因拟南芥进行 GUS 染色结果表明，BpSPL6 基因启动子驱动的 GUS 基因在转基因拟南芥中的表达具有时空特异性。在拟南芥的整个发育过程中，BpSPL6 基因启动子驱动 GUS 基因在真叶叶片中表达，但是表达部位不同。随着叶片的生长，首先在叶片的顶端表达，随后扩展到叶片的叶脉并直至整个叶片，并且表达量逐渐升高。同时 BpSPL6 基因启动子驱动的 GUS 基因在拟南芥营养生长时期的根部都有表达。并且经氯化钠和甘露醇胁迫后其表达量降低。对比两种胁迫，受到氯化钠胁迫后 GUS 基因的表达量变化更大，说明对氯化钠胁迫的响应更加强烈。【结论】BpSPL6 基因可能参与了植物的叶片、根发育以及对盐和干旱胁迫的响应。

　　本文源自李豆; 苏功博; 胡晓晴; 宋婷婷; 孙庆斌; 徐昭; 刘雪梅; 王宏伟， 北京林业大学学报 发表时间：2021-06-11

　　关键词：白桦;SPL;启动子;顺式作用元件;GUS 染色;盐胁迫;干旱胁迫

　　植物体内基因表达受到精密的调控，涉及到启动子、终止子、UTR 序列等调控元件，其中启动子序列具有主导作用[1]。高等植物基因表达主要由启动子与转录因子之间的相互作用来调控，启动子的应答序列决定了基因的特定表达[2] ，其表达模式可以反映相应基因的功能。

　　SPL(SQUAMOSA promoter binding protein-like)基因编码植物所特有的转录因子，最初从金鱼草(Antirrhinum majus)中发现，因其具 SQUAMOSA 启动子结合活性而得名[3] ，近年来陆续在其他植物中也发现了该类基因。SPL 基因都含有一个由 76 个氨基酸残基组成的高度保守的 SBP 结构域，包括 2 个锌指结构和 1 个核定位信号，以此结构域同下游靶基因启动子区结合，调控靶基因的表达[4]。SPL 基因在植物的生长发育过程中起着非常重要的作用，研究发现 SPL 基因参与植物幼年期向成年期的转变[5] 、营养生长向生殖生长的转变[6−7] 、花发育[8−9] 、孢子发生[10] 、叶片和根发育[11−13] 、逆境响应[14−16] 等多个过程。最近的研究表明，SPL 基因是许多植物非生物胁迫耐受性的关键调节因子。在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中 过 表 达 葡 萄 (Vitis pseudoreticulata)的 VpSBP16 基因，通过调节 SOS(salt overly sensitive)和 ROS(reactive oxygen species)信号通路，增强其对盐和干旱胁迫的耐受性[17]。MsSPL8 表达量的下调导致转基因苜蓿(Medicago sativa)的耐盐性和耐旱性增强[18]。BpSPL9 通过提高对 ROS 的清除，使白桦(Betula platyphylla)对盐和干旱胁迫具有耐受性[19]。

　　近年来已有多种高等植物转录因子的启动子被克隆并进行功能分析。毛果杨(Populus trichocarpa) PTLF 基因启动子可驱动 GUS 基因在杨树叶脉、嫩枝顶端的扩展叶和叶原基中表达[20]。水稻(Oryza sativa)OsGEX2 基因启动子是花粉特异性启动子，顺式作用元件分析发现其含有许多花粉特异性增强子元 件 LAT52/56 和 POLLEN1LE-LAT52[21]。 胡 杨(Populus euphratica)PeNAC1 基因启动子的活性受赤霉素和非生物胁迫诱导[22]。菊花(Chrysanthemum dichrum)DREB 转录因子的启动子 CdDREBa 受盐胁迫诱导[23]。水稻抗旱相关基因 OsGRAS1 上游 1 332 bp 启动子序列含有多个与干旱胁迫相关的调控元件，且其顺式作用元件的缺失和增加可以直接影响内源基因的表达[24]。白桦 BpSPL8 基因启动子区包含多种组织特异的启动元件和胁迫响应元件，且过表达 BpSPL8 基因能够降低拟南芥的耐旱性[25]。

　　白桦是我国东北地区的重要经济树种之一，其木材广泛用于建筑和家具行业。非生物胁迫会对白桦的生长发育造成严重的影响，研究白桦的非生物胁迫响应机制具有重要意义。因此本文克隆了 BpSPL6 基因的启动子，进行顺式作用元件分析，并对其转基因拟南芥在正常、盐和干旱胁迫条件下的表达模式进行了分析，可为进一步研究 BpSPL6 基因的功能提供参考，也可为了解白桦的抗逆机制提供依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 试验材料

　　用于提取基因组的白桦来自本实验室的组培白桦幼苗，以哥伦比亚野生型拟南芥作为受体材料。

　　试验试剂：植物表达载体 pBI121-GUS、大肠杆菌DH5α 和农杆菌EHA105 由本实验室保存，pMD18-T 载体购于宝生物工程有限公司。高保真酶 KODplus-Neo 试剂盒购自 TOYOBO 公司。Taq 酶、DNA 提取试剂盒、胶回收剂盒和质粒提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。T4 连接酶、限制性内切酶 HindⅢ和 BamHⅠ均购自 NEB 公司。

　　1.2 试验方法

　　1.2.1 白桦 BpSPL6 基因启动子的克隆

　　利用 CTAB 法提取白桦的总 DNA。根据白桦基因组数据库在 BpSPL6 基因上游 1 948 bp 处设计特异性引物。上游引物 BpSPL6-promoter1F：5′-ATGGGG ACCAAACACTTACTT-3′，下游引物 BpSPL6-promoter1R：5′-GCGAGTAAAGCTCTTTCACAA-3′。根据高保真酶 KOD-plus-Neo 试剂盒的反应体系，以白桦总 DNA 为模板，采用 3 步法的 PCR 程序，其中 56 ℃ 退火 30 s，68 ℃ 延伸 2 min，30 个循环，进行 PCR 扩增。胶回收目的片段，连入克隆载体 pMD18-T 并转入大肠杆菌 DH5α 中，经菌液 PCR 鉴定，挑选阳性克隆送至吉林省库美生物科技有限公司测序。

　　使用PLACE [26] 和Plant CARE [27] 在 线 软件分析 BpSPL6 基因启动子所含有的顺式作用元件。

　　1.2.3 植物表达载体构建

　　根据 BpSPL6 基因启动子序列设计酶切引物，F： 5 ′-GCAAGCTTATGGGGACCAAACACTTACTT-3 ′ (下划线标记为 HindⅢ酶切位点)，R：5′-GCGGATCC GCGAGTAAAGCTCTTTCACAA-3′(下划线标记为 BamHⅠ酶切位点)。以测序正确的克隆载体为模板，PCR 扩增带有酶切位点的启动子序列。将带有酶切位点的启动子序列与表达载体 pBI121-GUS 分别用 HindⅢ和 BamHⅠ限制性酶双酶切，切胶回收后用 T4 连接酶连接并转化大肠杆菌 DH5α，进行菌液 PCR 鉴定，挑选阳性克隆送至吉林省库美生物科技有限公司测序。

　　1.2.4 拟南芥的遗传转化

　　将测序正确的表达载体转化农杆菌 EHA105，进行菌液 PCR 鉴定，浸花法转化拟南芥[28]。收取成熟的种子播种于添加卡那霉素的 MS 培养基中进行筛选，2 周后将抗性幼苗移栽入土壤中，提取叶片 DNA 进行 PCR 检测，检测成功的幼苗收集种子用于后续试验。

　　1.2.5 白桦 BpSPL6 基因启动子的表达模式分析

　　将转 BpSPL6 基因启动子的拟南芥种子播种于 MS 培养基中，放入 4 ℃ 冰箱春化 2 d 后，于光照培养箱中分别培养 7、10、25 d 获得不同发育时期的拟南芥幼苗。将生长 14 d 的幼苗分别移植到 MS， MS+125 mmol/L 氯化钠，MS+200 mmol/L 甘露醇培养基中培养 3 d，获得正常条件下生长 17 d 的拟南芥和氯化钠和甘露醇胁迫 3 d 后的拟南芥幼苗。将以上拟南芥幼苗整株浸泡在 GUS 染液中过夜染色(每种处理均染色 3 株幼苗)，第 2 天用 V乙醇∶V乙酸 = 3∶1 脱色液脱色，每隔 1 h 更换脱色液直到绿色完全褪去，用显微镜观察 GUS 染色情况。

　　2 结果与分析

　　2.1 白桦 BpSPL6 基因启动子的克隆

　　根据白桦基因组数据库在 BpSPL6 基因上游 1 948 bp 处设计特异性引物。以白桦总 DNA 为模板，进行 PCR，电泳后得到一条 2 000 bp 左右的条带(图 1)。将此条带进行切胶回收后与 pMD18-T 克隆载体连接 ，转化大肠杆菌 ，进行测序。测序得到 1 703 bp 的序列，将测序结果分别与白桦和欧洲白桦(Betula pendula)基因组中 BpSPL6 基因启动子序列进行比对(图 2)，确定获得了 BpSPL6 基因的启动子。

　　2.2 白桦 BpSPL6 基因启动子顺式作用元件分析

　　使用 PLACE 和 Plant CARE 在线软件对 BpSPL6 基因启动子的顺式作用元件进行预测(表 1，图 3)。结果表明，BpSPL6 基因的启动子区包括核心启动元件 TATA-box、CAAT-box 和 4 种光响应元件(GT1- motif、Box 4、GA-motif、AT1-motif)，还包括多种激素响应元件，其中有 4 种生长素响应元件(AuxRRcore、TGA-element、CATATGGMSAUR 和 NTBBF1- ARROLB)，3 种赤霉素响应元件(GARE2OSREP1、 WRKY71OS、P-box)，1 种水杨酸响应元件(WBOXATNPR1)，2 种脱落酸响应元件(ABRE、DPBFCOREDCDC3)。另外发现 1 种花粉特异表达的顺式作用元件(POLLEN1LELAT52)和 1 种与根相关的顺式作用元件(ROOTMOTIFTAPOX1)。

　　值得注意的是，该启动子区还包括 4 种脱水响应元件 ，其中包括 5 个 MYB1AT，12 个 MYCCONSENSUSAT，4 个ACGTATERD1 和1 个MYBCORE 元件;2 种伤害响应元件，其中包括 7 个 WBOXNTERF3 元件和 33 个 DOFCOREZM 元件;4 个热激信号响应元件 CCAATBOX1。序列分析结果表明BpSPL6 基因很可能参与激素调节、花粉发育、根发育和干旱、盐、热胁迫等非生物胁迫的生物过程。

　　2.3 植物表达载体的构建

　　将测序正确的克隆载体和 pBI121-GUS 表达载体 用 双 酶 切 的 方 法 构 建 植 物 表 达 载 体 ， 菌 液 PCR(图 4)和测序鉴定均正确，说明表达载体构建成功，命名为 pBI121-BpSPL6 promoter::GUS。

　　2.4 拟南芥的遗传转化

　　将上一步构建好的植物表达载体转化农杆菌 EHA105，经菌液 PCR 检测成功后，采用浸花法转化拟南芥。用 CTAB 法提取拟南芥整株幼苗的 DNA，用特异性引物进行 PCR 检测(图 5)，选用 4 号泳道的株系进行后续试验。

　　2.5 白桦 BpSPL6 基因启动子在拟南芥中的表达模式

　　为了探究白桦 BpSPL6 基因启动子驱动的 GUS 基因在拟南芥中的表达模式，对不同发育时期的转基 因 拟 南 芥 植 株 进 行 GUS 染 色 。 研 究 表 明 ， BpSPL6 基因启动子驱动的 GUS 基因在拟南芥的不同发育时期表现出不同的表达模式。拟南芥植株春化后生长 7 d 以后，GUS 基因主要在根部(图 6A，C)表达，在真叶顶端(图 6A，B)也有微弱的表达。生长 10 d 后，GUS 基因在真叶叶片顶端(图 6D，E)和下胚轴(图 6D，F)有较高的表达量，同时在根(图 6D， G)、真叶叶片叶脉(图 6D，E)中也有表达，但是表达量较低。

　　当拟南芥植株生长 25 d 后，拟南芥已经进入生殖生长期，BpSPL6 启动子驱动的 GUS 基因在莲座叶的成熟叶片中表达量最高(图 7A，B)，在茎生叶以及莲座叶的幼嫩叶片的叶脉中有较低的表达(图 7A， C)，靠近花朵最幼嫩的叶片的顶端有微弱的表达(图 7D)，在拟南芥的花(图 7D)、雌蕊(图 7E)、雄蕊(图 7E)、以及角果(图 7F)及根部(图 7A，G)中均未检测到 GUS 基因的表达。

　　转基因拟南芥生长 17 d 时，拟南芥仍处于营养生长期，BpSPL6 基因启动子驱动 GUS 基因在整株拟南芥中都有较高的表达(图 8A，B，C，D)，明显高于生长 7 d(图 6A，B，C)和 10 d(图 6D，E，F)的表达量。

　　总之，在拟南芥的整个发育过程中，BpSPL6 基因启动子驱动的 GUS 基因在真叶叶片中都有表达，但是表达部位不同。随着叶片的生长，首先在叶片的顶端表达，随后扩展到叶片的叶脉直至整个叶片，并且表达量逐渐升高。同时 BpSPL6 基因启动子驱动的 GUS 基因在整个营养生长期的根部都有表达，但在生殖生长期只在拟南芥叶片的特定部位表达。

　　2.6 转基因拟南芥在盐和干旱胁迫下的表达模式

　　为了探究白桦 BpSPL6 基因在盐、干旱胁迫中的作用，我们将正常生长 14 d 的转基因拟南芥分别在正常条件和 125 mmol/L 氯化钠、200 mmol/L 甘露醇胁迫下培养 3 d 后，进行 GUS 染色并拍照分析其表达模式。结果表明，遭受氯化钠和甘露醇胁迫的转基因拟南芥与未处理的相比，BpSPL6 启动子驱动的 GUS 基因的表达量降低，在叶片(图 8A，B，C)、根(图 8A，D)下胚轴(图 8A，E)中都有明显的降低。两种胁迫相比，受到氯化钠胁迫后 GUS 表达量变化更大，说明 BpSPL6 基因启动子对氯化钠胁迫的响应更加强烈。总体而言，对转基因拟南芥进行盐、干旱胁迫处理后 BpSPL6 基因启动子驱动的 GUS 基因表达下调，说明该基因启动子响应于氯化钠和甘露醇胁迫，因此推测 BpSPL6基因可能在盐和干旱胁迫中发挥一定的作用。

　　3 讨　　论

　　SPL 基因编码植物特有的转录因子，在植物叶片发育、时期转变、花果发育、植物形态建成、赤霉素信号转导、孢子发生和对铜和真菌毒素的反应等方面发挥重要作用[29]。本研究发现 BpSPL6 基因启动子驱动的 GUS 基因在第 7、10、17 和 25 d 转基因拟南芥的叶片中均有表达，且表达量逐渐上升，在生殖生长期的成熟叶片中表达量达到最高。拟南芥叶片的生长发育需要 8 个 SPL 基因的参与[29−30]。与白桦 BpSPL6 基因同源的苜蓿 SPL13 基因过表达会导致苜蓿叶片卷曲[31]。同样拟南芥中 BpSPL6 的同源基因 AtSPL13 也 参 与 了 叶 片 的 发 育 [32]。 棉 花(Gossypium hirsutum)GhSPL3 和 GhSPL18 参与了叶片和第二芽的发育，且大多数 SPL 基因在叶片、茎和花中具有较高的转录水平[13]。说明 BpSPL6 基因很可能参与了叶片的发育。另外 SPL 基因与植物的阶段转变密切相关，在营养生长时期随着植物的生长， SPL 基 因 的 表 达 量 逐 渐 上 升 [7,29]。 在 本 研 究 中 BpSPL6 基因启动子驱动的 GUS 基因符合此表达模式。本研究中并未在拟南芥成熟的花和角果中发现 GUS 基因的表达 。前期研究发现 AtSPL13 基因(BpSPL6 基因的同源基因)在拟南芥幼花和发育中的花中高表达，但在成熟的花和长角果中表达量极低[29]。至于 BpSPL6 基因是否参与了花的发育过程还需要进一步验证。

　　近年来发现 SPL 基因参与了植物根的发育，拟南芥 SPL3、SPL9 和 SPL10 过表达会抑制侧根生长，同时过表达 SPL9 会增加初生根的长度[12]。最新研究发现拟南芥 rSPL10(与 miR156 结合位点发生突变，不受 miR156 的调控)过表达增加提高了分生组织的活性和初生根的长度[33]。本试验中 BpSPL6 基因启动子驱动 GUS 基因在转基因拟南芥营养生长期的根尖及根部其他部位表达，这与 AtSPL13 在根部的表达模式类似[32]。同时在营养生长时期其在根部的表达也随植物的生长逐渐增加，与前人研究一致。而且启动子区包含根发育相关的顺式作用元件 ROOTMOTIFTAPOX1，因此推测 BpSPL6 基因可能在植物的根发育过程中起作用。但是在生殖生长期的根部并未检测到其表达，具体原因需要进一步验证。

　　BpSPL6 基因启动子的顺式作用元件分析表明，其启动子区含有 10 种激素响应元件(生长素、赤霉素、水杨酸、脱落酸)。激素参与了植物生长发育的各个方面，已有多项研究表明 SPL 基因参与植物的激素响应过程。在拟南芥中 ，RNA-seq 研究发现 SPL10 对茉莉酸、水杨酸和生长素等激素响应有广泛的影响。SPL10 通过调节生长素生物合成抑制根的再生[34]。AtSPL8 是植物发育过程中响应赤霉素信号的组织依赖性调节剂，参与赤霉素生物合成和信号传递的基因表达量受到 AtSPL8 影响[35]。另外赤霉素通过调节茎分生组织中的 AtSPL3、4、5 基因促进开花[36]。苹果(Malus × domestica)在赤霉素胁迫后，大多数 MdSBP 基因显著下调。经脱落酸胁迫后，MdSBP1 基因的表达量显著上升，MdSBP8、21、 22 的表达量显著降低[37]。因此推测 BpSPL6 基因参与了植物的激素响应过程。

　　白桦 BpSPL6 基因启动子中还含有 4 种脱水响应元件(MYB1AT、MYCCONSENSUSAT、ACGTATERD1、MYBCORE)。已知盐和干旱胁迫都会造成植物的脱水，因此我们推测 BpSPL6 基因启动子参与盐和干旱的响应过程。为了验证这个设想，我们对 BpSPL6 基因启动子转基因拟南芥进行了氯化钠和甘露醇胁迫试验，发现胁迫后 BpSPL6 启动子驱动的 GUS 基 因 表 达 量 降 低 。 有 研 究 表 明 与 白 桦 BpSPL6 基因同源的苜蓿 SPL13 基因参与苜蓿的干旱胁迫过程，抑制 SPL13 基因的表达会降低苜蓿的耐 旱 性 [31]。 在 玉 米 (Zea mays)中 ， 57%(11/19)的 miR156 靶向的 SPLs受到盐或/和干旱的抑制[38]。拟南芥通过 miR156-SPLs-DFR 途径适应环境，以协调发育和非生物胁迫的耐受性。当拟南芥受到氯化钠和甘露醇胁迫后，SPL9、SPL10 基因的表达量显著下降[39]。我们发现当 BpSPL6 基因启动子转基因拟南芥受到氯化钠和干旱胁迫后，BpSPL6 基因启动子驱动的 GUS 基因表达量降低，这与前人对 SPL 基因在胁迫下表达模式的研究结果一致。这些结果表明 BpSPL6 基因很可能参与盐和干旱胁迫响应过程。

　　4 结　　论

　　本文获得了白桦 BpSPL6 基因上游 1 703 bp 的启动子序列。对启动子区的顺式作用元件预测发现除了含有核心启动元件外，还包括 2 种特异组织表达元件(根、花粉)，10 种激素响应元件(生长素、赤霉素、水杨酸、脱落酸)，4 种脱水响应元件等。GUS 染色结果表明，BpSPL6 基因启动子驱动的 GUS 基因在转基因拟南芥中的表达具有时空特异性。在拟南芥的整个发育过程中，BpSPL6 基因启动子驱动 GUS 基因在真叶叶片中表达，但是表达部位不同。同时在营养生长时期的根部都有表达。对转基因白桦分别进行氯化钠和甘露醇胁迫发现，两种胁迫后 GUS 基因的表达量降低，氯化钠胁迫后响应更为强烈。结果表明，BpSPL6 基因可能参与了植物的叶片、根发育以及对盐和干旱胁迫的响应。