基于AFLP分子标记的园艺风信子品种遗传多样性分析

　　摘 要 风信子作为春季园林景观中的流量花卉，应用方式灵活多样。由原种风信子(Hyacinthus orientalis) 培育而来的现代风信子品种资源极为丰富，部分园林常用品种存在同物异名或同名异物现象，本研究利用 AFLP 分子标记对风信子园艺品种进行有效分类，为新品种选育提供新思路。利用 64 对引物对 30 个常见园艺风信子品种进行AFLP分子标记测定，使用NTSYSpc2.1软件计算其遗传相似系数。并通过NTSYSpc2.1 软件中的 UPGMA 法构建聚类树状图。筛选出的 8 对 AFLP 引物通过 PCR 扩增获得条带 11 703 条，其中多态性条带 903 3 条，多态性比率为 77.18%;所有品种的遗传相似系数范围在 0.7 969~0.9 167 之间，平均值为 0.8 649。以相似系数 0.8 300 为阈值，30 个风信子品种可分为两大类群、两个亚类、五个组群，其中， White Pearl 和 Carnegie 相似系数最大，为 0.9 167;Jan Bos 和 Atlantic (2008)相似系数最小，为 0.7 969，小组群多个品种间的遗传系数均达到 0.9 000 以上(Sky Jacket 与 Aiolos (0.9 115)、 Purple Sensation 与 China Pink(0.9 005)、Pink Pearl 与 Blue Pearl (0.9 051))。聚类结果发现相同色系、倍性的品种几乎聚为一类,异色系中紫色系常作为中间色与其他色系聚为一类。通过 AFLP 分子标记鉴定的现代风信子园艺品种均具有较高的遗传多样性水平，遗传背景较窄，相同色系和倍性的园艺品种间亲缘关系最近，因此，可选用不同花色和倍性的风信子品种作为亲本进行优良新品种培育。

　　本文源自何元浩; 胡凤荣， 分子植物育种 发表时间：2021-05-21 09:27 《分子植物育种》杂志，于2003年经国家新闻出版总署批准正式创刊，CN:46-1068/S，本刊在国内外有广泛的覆盖面，题材新颖，信息量大、时效性强的特点，其中主要栏目有：新技术、新方法 、学术论坛与信息等。

　　关键词 风信子; AFLP; 园艺品种; 遗传多样性; 亲缘关系

　　风信子(Hyacinthus orientalis)，别名洋水仙、五色水仙，属于百合科(Liliaceae)风信子属(Hyacinthus)的多年生草本花卉(Hu et al., 2015)。风信子原产于南非与地中海地区(Van Sheepen, 1992)，1562 年从土耳其引入东欧地区后，开始进行品种选育和庭院栽培。风信子园艺栽培品种极多，世界上荷兰最多，是其重要的外贸商品(刘燕, 2016)。作为多年生秋植球根，风信子花朵繁密素雅，是冬春季节花卉市场和园林景观中的流量花卉。目前，国内外对风信子的研究主要集中在引种栽培(王春彦等, 2009)，花期调控(张鸽香和周丽琴, 2013)，组织培养(Roxana et al., 2018; Selay et al, 2020)等方面，关于分子标记的研究报道较少(胡凤荣等, 2015; 贺功振等, 2017)。

　　由于外在气候环境与内在遗传变异的影响，仅通过花、叶、果等简单形态学表型标记很难真实反映品种间的遗传背景和亲缘关系。以 DNA 为基础的分子标记技术既不受环境条件的影响，也不受基因表达与否的限制，是鉴定种质资源差异性最直接有效的遗传分析方法(张德水和陈受宜, 1998)。由荷兰科学家 Vos 创建发展的 AFLP (Amplified fragment length polymorphism)分子标记技术(Vos et al, 1995)，结合了 RFLP 与 RAPD 分子标记技术的特点，只需少量纯化的基因组 DNA 便可进行限制性酶切与选择性扩增，具有重复性好，稳定性强，分辨率高等优点，广泛用于种质资源鉴定与遗传多样性分析(王姗姗等, 2019)。为深入了解园艺风信子品种间的遗传结构和遗传多样性，本研究采用 AFLP 分子标记技术对 30 个风信子园艺品种的遗传背景和亲缘关系进行分析，拟揭示出风信子品种间的遗传多样性与亲缘关系，为探究重要性状机理和选育新品种提供分子生物学基础。

　　1 结果与分析

　　1.1 风信子 AFLP 标记多态性分析

　　以 30 个品种样品的 DNA 为模板进行 AFLP-PCR 扩增，对 64 对引物组合中筛选出 8 对条带清晰，多态性较好的引物(表 1)。8 对引物共扩增产出条带 11 703 条，其中多态性条带 9 033 条，多态性比率为 77.18%。每对引物扩增产生条带数在 1 377~1 583 之间，平均为 1 462.87 条。其中，引物 E5-M5 多态性比率最高，为 83.19%，引物 E5-M3 多态性比率最低，为 70.95%，8 对引物扩增产生多态性条带比率均较高(表 2)。E5-M1 引物对 30 个品种样品的扩增结果，所得扩增产物条带清晰，易于分辨，表明所选的引物组合多态性较好(图 1)。

　　1.2 风信子遗传多样性分析

　　使用 NTSYSpc2.1 软件计算 30 个品种间的遗传相似系数，并构建遗传相似系数(GS)矩阵表(表 3)，30 个风信子品种的 GS 值 0.7 969~0.9 167 之间，平均值为 0.8 649。由 GS 矩阵表看出，30 个园艺品种中， White Pearl 与 Carnegie 品种间 GS 值最大，为 0.9 167，亲缘关系最近;Jan Bos 与 Atlantic (2008)品种间 GS 值最小，为 0.7 969，亲缘关系最远。同时，Aiolos 与其他品种间的 GS 平均值最大，为 0.8 837;Jan Bos 与其他品种间的 GS 平均值最小，为 0.8 264，表明 Aiolos 与其他品种间的遗传相似性较高，亲缘关系较近; Jan Bos 与其他品种间的遗传相似性较低，亲缘关系较远。

　　1.3 聚类分析

　　基于遗传相似系数，使用 NTSYSpc2.1 软件，通过 UPGMA 法对 30 个风信子样品进行聚类图构建(图 2)。当 GS 值为 0.8 300 时，30 个风信子品种在遗传聚类上被分为 A、B 两大类群，其中，品种 Jan Bos 单独归为 A 类群，其他 29 个品种归为 B 类群，B 类群可分为 C、D 两个亚类，C 亚类可细划分为 E、F、G 三个组群，包括 11 个品种(City of Hearlem, Fondant, Apriaot Passion, Blue Magic, White Pearl, Carnegie, Anna Liza, Minos, Atlantic (2010), Gipsy Princess, Atlantic (2008))，D 亚类可细划分为 H、I 两个组群，包括 18 个品种(Gipsy Queen, Anna Marie, Sky Jacket, Aiolos, Amethyst, Antarctica, Wood Stock, Pink Surprise, Blue Star, Delf Blue, Purple Sensation, China Pink, Pink Pearl, Blue Pearl, Splendid Cornelia, Ostara, Red Magic, Peter Stuyvesant)。从聚类结果可以看出，30 个风信子园艺品种间的遗传范围较窄，亲缘关系较近。

　　2 讨论

　　物种或居群的遗传多样性源自于自身的长期进化，其遗传多样性的丰富程度与其适应环境的能力呈正相关，对物种遗传多样性的深入研究可揭示该物种的进化历史，为分析其进化潜力和未来命运提供一定的遗传基础(Pamela and Douglas, 1991; 沈浩和刘登义, 2001)。本研究通过 AFLP 分子标记技术对 30 个风信子品种展开实验，利用筛选的 8 对引物，在 30 个品种上均能获得条带清晰的 AFLP 指纹图谱，表明 AFLP 技术能稳定、有效的鉴定和区分风信子种质资源。30 个风信子品种的 AFLP 分子标记鉴定共扩增产生 11 703 条，其中多态性条带 9 033 条，多态性比率为 77.18%，略高于贺功振等(2017)采用 12 条 RAPD 引物对 20 个风信子品种扩增所得 72.0%的多态性比率，而低于胡凤荣等(2015)采用 12 条 ISSR 引物对 29 个风信子品种扩增所得 94.5%的多态性比率，对同一物种采用不同的分子标记方法获得多态性存在一定差异。此外，林鸿等(2012)对 23 份鸢尾种质进行 AFLP 分析，多态位点百分率为 86.3%。张克中等(2008)采用 8 对引物对 24 份野生百合种质进行 AFLP 分子标记，所得扩增产物多态性比率为 82.3%。黄平(2012)选取 14 对 AFLP 引物对 71 个月季品种进行扩增所得多态性条带占比 95.78%。通过对不同类型(宿根; 木本)的花卉对比可以看出，风信子品种虽然多态性略低于进化历史悠久的鸢尾、月季，但仍保持较高的多态性。与同为球根的百合相比，多态性存在差异可能源自栽培种与野生种、居群结构、球根类型等的差异。由此可见，AFLP 分子标记能够更为有效的的分析风信子品种间的遗传多样性。

　　本研究根据风信子种质材料的遗传相似系数对 30 个风信子品种进行了聚类分析。当 GS 值为 0.8 300 时，遗传聚类上可划分为 2 大类群。Jan Bos 单独构成一大类群 A，同为红色的 Red Magic 没有与之聚为一类可能源自于倍性的差异或品种起源不同，且Jan Bos和Atlantic (2008)品种间的相似系数最低，为0.7 969，这两个品种花色、倍性均不相同，推测可能分别起源自亲缘关系较远的二倍体。另一大类群 B 由 29 个品种构成，其中在 GS 值为 0.8 560 时可分为 C、D 两个亚类，C 亚类的 E 小组群中 White Pearl 与 Carnegie 品种间的相似系数最高，达到 0.9 167，两品种同为白色系，染色体数相近，同为四倍体，可能 White Pearl 是 Carnegie 丢失了一条染色体变异而来;F 组群中的 Anna Liza 与 Minos 品种间的 GS 值也高达 0.9 039，虽然两品种都为整倍体，但色系、倍性均不同，推测可能 Minos 是 Anna Liza 的一个染色体组加倍而来，，也可能是产生了二倍体的雌雄配子或是染色体组在加倍过程中出现了基因突变或染色体结构变异。四倍体的蓝色系品种 Atlantic (2008)单独构成 G 组群。在 D 亚类的 H 组群中，同为蓝色系，染色体数目相同的四倍体品种 Blue Star 与 Delf Blue 品种间也展现出极高的遗传相似性，说明这两个品种亲缘关系较近，遗传差异性较小，这与胡凤荣等(2015)的研究结果一致;该组群中多组品种间遗传系数均较高：Sky Jacket 与 Aiolos (0.9 115)、Purple Sensation 与 China Pink (0.9 005)、Pink Pearl 与 Blue Pearl (0.9 051)。H 组群品种较多，从花色上来看，多数为紫蓝，紫粉，粉蓝等组合，各品种间的遗传相似系数较小，说明亲缘关系近，可能一个品种起源于另一个品种或是起源相同，只是在变异过程出现了基因变异或染色体数目或结构的变异。I 组群由 Red Magic 与 Peter Stuyvesant 两品种组成，两品种花色不同，倍性相同，展现出高度的相似性，推测 Red Magic 可能是 Peter Stuyvesant 丢失一条染色体产生新品种。通过聚类结果可以看出，虽然 30 个品种间存在着一定的遗传差异，但现代风信子的园艺品种都是由原种风信子(Hyacinthus orientalis)，以及浅风信子(var.albulus)、大筒浅白风信子(var.praecox)、普罗文斯风信子(var.provincialis) 3 个变种经过不断选育杂交而来，遗传背景相对单一，亲缘关系都较近(英国皇家园艺学会, 2000)。除同色系品种，蓝色、紫色、粉色系品种间常聚为一类，这与苏晓倩等(2019)的色差分析结果一致，各品种中花色苷种类及比例不同使花色产生的差异(陶秀花等, 2015)，也是导致聚类结果不同的原因之一。

　　风信子园林应用方式灵活多样，是布置花坛、花镜优良的材料。鉴于风信子品种繁多，基于 AFLP 分子标记可有效检查各品种间同物异名或同名异物现象。本研究通过 8 对 AFLP 引物对 30 个风信子品种进行扩增产生条带 11 703 条，多态性条带 9 033 条，多态性比率为 77.18%，较高的多态性以及遗传多样性表明风信子具有较强的环境适应能力。聚类分析将 30 个品种分为与倍性和花色系相关的两大类群，两个亚类，五个组群。该研究结果可为风信子遗传多样性分析、遗传性状鉴定以及新品种选育提供分子水平上理论依据。

　　3 材料与方法

　　3.1 试验材料

　　30 个风信子园艺品种样品采集于南京林业大学园林实验教学中心温室(118.83°E, 32.08°N)，。风信子染色体基数为 8，二倍体为 16 条染色体、三倍体和四倍体存在非整倍体，染色体数目分别为 23~25、30~32 条染色体(表 4)。每一品种样品采集生长良好，无病虫害的新鲜幼嫩叶片，液氮保存。

　　3.2 基因组 DNA 的提取

　　以 30 个风信子园艺品种的叶片为材料，通过简易 CTAB 法提取其样品基因组 DNA (胡凤荣, 2011)。通过 0.8%琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 质量。

　　3.3 风信子 AFLP-PCR 分析

　　限制性酶切与连接：利用 EcoRI 和 MseI 内切酶构建双酶切与连接体系，反应体系总体积为 20 μL： DNA 模板(50 ng/μL) 4 μL，Adapter 1 μL，EcoRI/MseI 2 μL，ATP(10 μmol /L) 2.5 μL，T4 Ligase 1 μL，补足 ddH2O 至 20 μL。将混合液混匀数秒，37 ℃保温 5 h，之后 8 ℃保温 4 h，4 ℃过夜。

　　预扩增：选择 EcoRI (5’> GAC TGC GTA CCA ATT CA< 3’)与 MseI (5’> GAT GAG TCC TGA GTA AC<3’)为预扩增引物，反应体系总体积为 25 μL：连接后的 DNA 模板 2 μL，Pre-ampmix (预扩引物) 1 μL， dNTPs (10 μmol /L) 0.5 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，Taq DNA 聚合酶(2U/μL) 0.5 μL，补足 ddH2O 至 25 μL。离心数秒,按下列参数进行 PCR 扩增：94 ℃，2 min;94 ℃，30 s，56 ℃，30 s，72 ℃，80 s，30 个循环;最后 72 ℃延伸 5 min，4 ℃保存。

　　选择性扩增：预扩产物 1:20 稀释后作为选扩模板，选择 EcoRI/MseI 引物组合进行选择性扩增，反应体系总体积为 25 μL：预扩稀释样品 2 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，dNTPs (10 μmol /L) 0.5 μL，EcoRI 引物 1 μL，MseI 引物 1 μL，Taq DNA 聚合酶(2U/μL) 0.5 μL，补足 ddH2O 至 25 μL。将混合液混匀离心数秒,按下列参数进行 PCR 扩增： 94 ℃，30 s，65 ℃，30s，72 ℃， 80 s 为第 1 个循环;以后每轮循环温度递减 0.7 ℃，扩增 12 轮;接着按 94 ℃，30 s，55 ℃，30 s，72 ℃，80 s，扩增 23 轮;最后 72 ℃延伸 5 min， 4 ℃保存。

　　PCR 扩增反应在 Gene Amp PCR System 9600 扩增仪(Perkin Elmer, USA)上完成，内切酶与 T4 连接酶均购自 New England Biolabs (NEB) 公司，引物设计由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司完成。4%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增产物。

　　3.4 数据分析

　　通过测序仪电泳检测后的原始数据 30 个样品，8 对引物组合通过 GENESCAN 软件进生物学分析，根据电泳的结果，在原始数据的基础上，有带的地方替换为 1，无带的地方替换为 0，构成 01 数据。使用 NTSYSpc2.1 软件计算 30 个品种的遗传相似系数，并根据相似系数使用 UPGMA 法进行聚类分析。

　　作者贡献

　　何元浩是本研究的实验设计者和实验研究的执行人，完成数据分析，论文初稿的写作;胡凤荣是项目的构思者及负责人，指导实验设计、数据分析、论文写作与修改。两位作者都阅读并同意最终的文本。

　　致谢

　　本研究由国家级林业科技成果推广项目“风信子优良品种及鳞片扦插繁殖技术推广”(2015[20]号)和江苏高校品牌专业建设工程资助项目(PPZY2015A063)共同资助。