摘要为了评价草莓叶水提物(SLWE)延缓皮肤衰老功效,对SLWE成分、抗氧化活性、抑制非酶糖基化(NEG)能力进行了测定;探讨了SLWE对人包皮成纤维细胞(HFF-1)细胞活率、HFF-1中透明质酸(HA)、人Ⅰ型胶原蛋白(COLⅠ)、羟脯氨酸(HYP)、基质金属蛋白酶1(MMP-1)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)含量的影响。在中波紫外线(UVB)致HFF-1损伤模型基础上,考察了SLWE对保护组活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)、MMP-1和超氧化物歧化酶(SOD)的影响,探讨SLWE对UVB致HFF-1损伤保护机制。结果表明,SLWE富含VC、槲皮素、绿原酸、没食子酸及儿茶素类物质,其中,槲皮素含量12.86mg/L,表儿茶素含量10.13mg/L。SLWE自由基清除能力良好,清除不同自由基能力依次为O2-•>DPPH>ABTS>亚铁离子螯合>•OH;体积分数为1%的SLWE水溶液对NEG的抑制率为87.17%;体积分数大于3%的SLWE水溶液可提高HFF-1中HA、COLI和HYP含量(P<0.05),体积分数为6%的SLWE水溶液可降低MMP-1含量(P<0.01),表明SLWE具有提升皮肤含水量,增加胶原含量,抑制胶原降解,实现延缓衰老的功效;SLWE可有效降低因UVB刺激而产生的ROS,体积分数6%的SLWE水溶液可显著降MDA,抑制MMP-1表达,提高SOD活力,说明SLWE有助于缓解氧化应激造成的细胞损伤。
本文源自精细化工 发表时间:2021-03-18《精细化工》(月刊)创刊于1984年,是中国化工学会精细化工专业委员会、中国精细化工协会(筹)会刊,由大连化工研究设计院(原化工部大连化工研究设计院)等单位主办,是中国化工、轻工类核心期刊、中国科技核心期刊,1984年6月创刊,是中国创办精细化工专业技术刊物。
关键词草莓叶水提物;UVB;人包皮成纤维细胞;损伤保护;延缓衰老;医药与日化原料
成纤维细胞分泌的胶原纤维、弹性纤维及基质成分,对维持皮肤正常生理状态具有重要意义。皮肤经紫外线长期或大量照射后,会引发光损伤[1],UVB刺激皮肤产生过多活性氧(ROS),激活细胞氧化应激反应,脂质、蛋白质氧化、线粒体及DNA受损、细胞膜通透性改变,成纤维细胞周期停滞和凋亡,进而引起皮肤细胞外基质中的胶原蛋白、弹性蛋白及透明质酸降解,造成组织损伤,加速皮肤老化[1-2]。目前,针对草莓的精深加工主要集中在草莓果实,而草莓叶作为草莓生产过程的副产品,大多采用填埋、焚烧等处理方式,存在环境污染等问题。针对不同叶龄的草莓叶制作的草莓叶保健茶研究发现,其含有大量VC、鞣花酸、可溶性糖、原花青素、槲皮素、儿茶素、游离氨基酸等,尤其是VC,其含量可高达每百克叶片160~170mg[3-4],具有良好的抗氧化活性及延缓衰老功效。但目前针对草莓叶提取物相关功效评价的研究较少,作用机制不明确。
本研究制备了草莓叶水提物(SLWE),并对其进行成分测定、抗氧化及延缓衰老功效评价,同时探讨SLWE对UVB致成纤维细胞损伤保护机制,为其在延缓皮肤衰老方面的应用提供依据,推动草莓副产品价值的深入挖掘和应用。
1实验部分
1.1材料、试剂与仪器
草莓(Fragaria×ananassa)叶片,北京欣宝莱科技有限公司提供。甲醇、乙腈、乙酸、pH2.5磷酸水溶液(色谱级),盐酸氨基胍、牛血清白蛋白(BSA)、葡萄糖、甲醇、醋酸钠、无水三氯化铁(FeCl3)、七水合硫酸亚铁(FeSO4•7H2O)(以上均为AR),美国Sigma-Aldrich公司;DMEM高糖培养基、磷酸缓冲盐溶液(PBS),美国Hyclone公司;青链霉素混合液(100×)、胰酶-EDTA、小牛血清(FBS)(以上均为AR),美国ThermoFisher公司;CellCountingKit(CCK-8)试剂盒、活性氧(ROS)试剂盒、总SOD活性检测试剂盒(WST-8法)、透明质酸(HA)试剂盒,碧云天生物技术公司;丙二醛(MDA)检测试剂盒、羟脯氨酸(HYP)试剂盒,南京建成生物研究所;人I型胶原(COLI)酶联免疫检测试剂盒、人基质金属蛋白酶1(MMP-1)试剂盒、人基质金属蛋白酶9(MMP-9)试剂盒,武汉华美生物有限公司;人包皮成纤维细胞(HFF-1),中国科学院干细胞库;去离子水,自制。
Agilent1220InfinityII液相色谱系统,AgilentZORBAXEclipsePlusC18柱(250mm×4.6mm×5µm),AgilentZORBAXSB-Aq柱(250mm×4.6mm×5µm),安捷伦科技(中国)有限公司;InfiniteM200PRO酶标仪,瑞士Tecan公司;IX73研究级荧光倒置显微镜,奥林巴斯(中国)有限公司;LGJ-18真空冷冻干燥机,北京松源华兴科技发展有限公司;EB-160C/FC手持式紫外灯,美国Spectroline公司。
1.2SLWE制备
将新鲜草莓叶置于真空冷冻干燥机中,在真空度100Pa,功率1400W,-60℃条件下,干燥24h,冰上磨粉,过100目筛,得到草莓叶冻干粉。按料液比1:20(g:mL)加入草莓叶冻干粉和去离子水,在常温(20℃),60Hz条件下超声辅助浸提0.5h后,于8000r/min离心10min,离心处理2次,取黄绿色上清液,即为SLWE,用孔径为0.22μm微孔滤膜过滤除菌,备用。
1.3SLWE成分测定
利用高效液相色谱仪对SLWE成分进行测定,主要依据国标或卫生标准中的方法。以VC为例,其测试原理为:以VC标准品和去离子水制备不同质量浓度的VC标准工作液,再对测试样以色谱峰的保留时间定性,通过外标法对其进行定量。
按照GB5009.86—2016《食品安全国家标准食品中抗坏血酸的测定》第一法测定VC含量;按照《保健食品检验与评价技术规范(2003年版)》保健食品功效成分及卫生指标检验规范第二部分(十六)测定槲皮素含量;按照GB/T22250—2008《保健食品中绿原酸的测定》测定绿原酸含量;按照GB/T8313—2018《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》测定没食子酸和儿茶素类含量。
1.4SLWE抗氧化活性测定
1.4.1还原力测定
采用铁离子还原/抗氧化能力(FRAP)法[5],以0.1mmol/LTrolox为阳性对照,以自制去离子水稀释,测定SLWE(体积分数分别为0.01%、0.1%、1.0%、2.5%、5.0%、10.0%)水溶液的FRAP值。
1.4.2自由基清除能力测定
以自制去离子水稀释,以VC(质量分数0.1%)水溶液为阳性对照,参照XIE等[6]方法测定SLWE(体积分数分别为0.10%、0.25%、1.00%、2.50%、10.0%、100.00%)水溶液的DPPH•清除能力;参照RE等[7]方法测定SLWE(体积分数分别为0.10%、0.25%、1.00%、10.00%、100.00%)水溶液的ABTS•清除能力;采用邻苯三酚自氧化法[5],测定SLWE(体积分数分别为0.10%、0.25%、1.00%、2.50%、10.00%)水溶液的O2-•清除能力。采用YOU等[8]方法测定SLWE(体积分数分别为0.10%、1.00%、2.50%、10.00%、100.00%)水溶液的•OH清除能力;以EDTA-2Na(质量分数0.01%)水溶液为阳性对照,参考GÜLÇIN[9]方法测定SLWE(体积分数分别为0.10%、0.25%、1.00%、2.50%、10.00%)水溶液的金属离子螯合能力。
1.5SLWE抑制非酶糖基化(NEG)能力
参考庄秀园[10]的方法,以质量分数为0.1g/L的盐酸氨基胍水溶液为阳性对照,pH7.4PBS为空白对照,样品自身荧光强度为样品本底对照,以激发波长370nm和发射波长440nm检测荧光强度,测定SLWE(体积分数分别为0.1%、0.2%、1.0%、10.0%、100.0%)对NEG的抑制率,按式(1)计算。NEG抑制率/%=[1-(A样品-A样品本底)/A空白]×100(1)
1.6SLWE对正常生长HFF-1的影响
1.6.1HFF-1细胞培养
选择生长状态良好、对数生长期的HFF-1置于DMEM高糖培养基[含10%胎牛血清(体积分数)、100U/mL青霉素钠、100mg/L链霉素],于37℃、5%CO2(体积分数)、饱和湿度进行培养,每3d更换1次培养基。生长约80%融合时,V〔0.25%(质量分数)胰酶〕:V(EDTA)=1:2培养基,进行HFF-1传代。
1.6.2SLWE对HFF-1活率影响测定
参考刘珊等[11]方法,以添加细胞培养基为空白对照,只铺细胞不加样品为阴性对照,采用CCK8检测SLWE(体积分数分别为0.2%、0.4%、0.8%、1.6%、3.1%、6.25%、12.5%、25%、50%、100%)水溶液对HFF-1活率的影响。
1.6.3SLWE对HFF-1中HA、COLI和HYP含量影响的测定
HFF-1接种密度3×104个/孔,培养6h完全贴壁后,以VC(质量分数0.01%)为阳性对照,只铺细胞不加样品为阴性对照,参照HA、COLI和HYP含量测定试剂盒说明书,对SLWE(体积分数分别为1.5%、3%、6%)水溶液处理HFF-1中HA和HYP含量,SLWE(体积分数分别为0.1%、1.5%、3%、6%)水溶液处理HFF-1中COLI含量进行测定。
1.6.4SLWE对HFF-1中MMP-1、MMP-9含量影响
HFF-1接种密度3×104个/孔,培养6h贴壁,以VC(质量分数0.01%)为阳性对照,只铺细胞不加样品为阴性对照,按人MMP-1和人MMP-9试剂盒说明书,测定SLWE(体积分数体积分数分别为1.5%、3%、6%)水溶液处理HFF-1中MMP-1、MMP-9含量。
1.7SLWE对UVB致HFF-1损伤保护
1.7.1建立UVB致HFF-1损伤模型的SLWE保护组
选择生长状态良好、对数生长期的HFF-1,接种密度3×104个/孔,建立实验分组。空白组:不照射UVB,不加测试样品,细胞正常培养60h;UVB损伤组(辐照剂量68mW/cm2):细胞正常培养48h后,在功率密度68µW/cm2,照射距离10cm条件下,UVB辐照100s后,培养24h;保护组:细胞正常培养24h后,在含SLWE(体积分数分别为0.3%、0.6%、6%)水溶液培养基条件下培养24h,最后,在功率密度68µW/cm2,照射距离10cm条件下,UVB辐照100s后,再培养24h。采用CCK-8[13]检测UVB辐照对HFF-1细胞活率的影响。
1.7.2SLWE对HFF-1损伤保护组ROS、MDA、MMP-1和SOD的影响
采用DCFH-DA法检测ROS含量,MDA、MMP-1含量测定参见试剂盒说明书,采用WST-8法检测SOD含量。
2结果与讨论
2.1SLWE成分测定
采用高效液相色谱法对SLWE中的VC、槲皮素、绿原酸、没食子酸及儿茶素类进行鉴定,高效液相色谱图如图1所示,测定结果如表1所示。
如表1和图1所示,SLWE富含VC、槲皮素、绿原酸、没食子酸及儿茶素类,槲皮素含量最高,达12.86mg/L,表儿茶素10.13mg/L。研究发现,儿茶素类是草莓叶中的主要抗氧化剂之一[12],同时草莓叶富含VC[13]、槲皮素[14-15]、没食子酸[16-17]、绿原酸[18]等,均为已知抗氧化剂,说明SLWE具有作为抗氧化剂的可能。
2.2SLWE抗氧化活性测定
2.2.1还原力测定
依据SLWE对Fe3+的还原力评价其抗氧化能力,拟合得到的FeSO4•7H2O回归方程为y=0.3405x+0.0017(R2=0.998),结果见图2。
如图2所示,SLWE的FRAP值呈现剂量-效应关系,体积分数为10%的SLWE水溶液的FRAP值与阳性对照0.1mmol/LTrolox相当,说明SLWE具有较强的抗氧化能力。
2.2.2自由基清除能力测定
2.2.2.1DPPH•和ABTS•清除能力
DPPH•是一种很稳定的以氮为中心的醇溶性自由基[19],过硫酸钾将ABTS氧化成相对稳定的水溶性ABTS•,可用于评价抗氧化剂的抗氧化能力。SLWE的DPPH•和ABTS•清除能力结果如图3、4所示。
如图3、4所示,体积分数0.1%SLWE水溶液DPPH•清除率为42.98%,体积分数1%SLWE水溶液DPPH•清除率为97.58%,增幅为54.60%,具有显著差异(P<0.001),其IC50值(半抑制浓度)为0.062g/L,低于VC的IC50值0.008g/L[20]。当SLWE体积分数为0.1%~1%时,ABTS•清除率从22.21%升到90.80%,增幅68.59%,具有显著差异(P<0.001),其IC50值为0.219g/L,与VC的IC50值0.21g/L[21]相比,没有显著差异(P>0.05),说明SLWE具有较强的ABTS•清除能力。
目前,测定抗氧化活性方法主要分为两类,基于氢原子转移(HAT),包括氧化自由基吸收能力(ORAC)、硫代巴比妥酸反应产物法(TBARS)、硫氰酸铁法(FTC)等和基于电子转移(SET),包括DPPH、ABTS和FRAP等[22-23]。相比于HAT方法,SET方法以测定样品氧化还原潜力为基础,重复性好,灵敏度高,是目前使用最广泛的抗氧化测定方法[24-25],因此,本研究通过分析DPPH、ABTS和FRAP的相关性(表2),评价SLWE总抗氧化能力。
如表2所示,DPPH与ABTS方法间达到显著相关(P<0.01,r=0.94),而FRAP与DPPH、ABTS方法间均没有显著性差异,相关系数分别为0.21、0.30。原因在于DPPH与ABTS是模拟自由基与抗氧化物质反应,抗氧化物质通过给电子以清除自由基,而FRAP法基于Fe3+在强还原剂条件下生成Fe2+,以抗氧化剂强的还原能力为基础[26]。体积分数1%SLWE水溶液的DPPH•与ABTS•清除率分别为90.80%与97.58%,与体积分数0.1%VC水溶液(95%)相近,可见SLWE自由基清除能力不仅是VC起作用,而是多种物质协同作用结果。此外,体积分数1%SLWE水溶液的FRAP值为0.45(图2),小于自由基清除能力。
2.2.2.2•O2-、•OH清除能力及螯合亚铁离子能力
体内自由基源于线粒体P450氧化酶类将氧气氧化为O2-•,进而生成H2O2,H2O2经过氧化氢酶或还原型谷胱甘肽过氧化物酶分解生成水,或由亚铁离子氧化成•OH,最终生成H2O排出体外。O2-•是所有活性氧自由基前体,与生物体炎症发生、衰老及癌症等重大疾病有密切关系[27]。•OH可造成糖类、氨基酸、蛋白质、核酸和脂类等物质氧化损伤,使细胞坏死或突变,是目前所知活性氧自由基中对生物体毒性最强、危害最大的一种。因此,为避免•OH产生,螯合亚铁离子使H2O2尽可能分解为H2O十分重要。SLWE对O2-•和•OH自由基清除能力及螯合亚铁离子能力结果如图5所示。
如图5所示,当SLWE体积分数为0.1%~1%时,对O2-•的清除率从47.20%升到100.00%,增幅为52.80%,具有显著性差异(P<0.001),其IC50值为0.055g/L,远低于VC的IC50值0.460g/L[21](P<0.001),说明SLWE具有很强的清除O2-•活性。此外,SLWE对•OH清除作用和螯合亚铁离子能力与SLWE成剂量依赖,体积分数10%SLWE水溶液•OH清除率为59.27%,亚铁离子螯合率为100%,其IC50值分别为3.365和1.381g/L。
SLWE不同自由基清除能力IC50值如表3。
如表3所示,SLWE清除不同自由基能力依次为O2-•>DPPH•>ABTS•>亚铁离子螯合>•OH,说明其具有良好的抗氧化活性,可通过清除多种活性氧及自由基,螯合金属离子来抵抗引起身体及皮肤衰老。根据罗学兵[3]研究发现,草莓叶冻干粉中富含可溶性糖、总酚、黄酮、VC、原花青素等物质,同时本研究发现SLWE富含多种具有抗氧化活性物质,说明SLWE中不是单一活性成分起作用,而是多种活性成分共同作用的结果,为其开发延缓衰老化妆品和保健品提供了理论依据。
针对不同自由基清除能力分析,与O2-•清除相比,SLWE对•OH清除与亚铁离子螯合作用相对较弱,但从总体看,SLWE有强烈清除O2-•作用,大大减少H2O2生成,同时具有亚铁离子螯合作用,使得•OH产生量减少,从而促进过氧化氢酶或还原型谷胱甘肽过氧化物酶分解H2O2生成水。综上,SLWE是一种天然的强抗氧化剂,可从多通路达到抗氧化效果。
2.3SLWE抑制NEG能力测定
糖化学说是皮肤衰老三大主流学说之一,还原糖羰基端与蛋白质氨基端在非酶促条件下自发性缩合,最终产生高级糖基化终产物(AGEs),使蛋白质交联产生荧光,呈现褐色[10]。胶原蛋白糖化交联是导致组织弹性、柔韧性降低的主要原因之一[28],会诱导产生ROS,消耗体内抗氧化酶系统[29],促进黑色素产生[30],引起皮肤衰老。利用美拉德反应原理测定SLWE(体积分数分别为0.1%、0.2%、1%、10%、100%)抑制NEG能力,结果见图6。
如图6所示,SLWE对NEG的抑制呈现明显的剂量-效应关系。体积分数0.1%SLWE水溶液NGE抑制率为54.46%,体积分数1%SLWE水溶液NGE抑制率为87.17%,大于体积分数1%盐酸氨基胍水溶液NGE抑制率(84.32%),且具有显著性差异(P<0.05),表明SLWE对NEG有很强的抑制作用。
2.4SLWE对正常生长HFF-1的影响
2.4.1SLWE对HFF-1活率影响
CCK-8试剂盒是一种广泛用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒,其检测SLWE对HFF-1活率影响结果见图7。
如图7所示,当SLWE体积分数为0.40%~6.25%内,HFF-1活率均在90%以上,说明SLWE在体积分数为0.40%~6.25%内对HFF-1活率无影响。当SLWE体积分数增至12.5%~25.0%时,HFF-1细胞活率急速降低,由93.91%降至30.64%,降幅为63.27%,具有显著性差异(P<0.001),说明SLWE体积分数大于12.5%后,对HFF-1活率存在明显影响。因此,选择体积分数6.25%作为后续实验SLWE最大添加量。
2.4.2SLWE对HFF-1中HA、COLI和HYP含量影响
HA和COL是皮肤的主要基质成分[31],而HYP作为COL的特征性成分,可间接反映COL的合成情况,因此,测定SLWE对HFF-1中HA、COLI和HYP含量的影响,可反映其对皮肤的直接正向作用,结果如图8所示。
如图8所示,与空白对照相比,体积分数大于3%的SLWE水溶液可提高HFF-1中HA、COLⅠ和HYP含量(P<0.05);与阳性对照相比,SLWE对HYP、COLⅠ和HA的促进作用与体积分数0.01%VC水溶液趋势相同,推测SLWE可通过提高HA含量为皮肤提供一个稳定环境,提升皮肤水含量,继而通过增加胶原蛋白含量达到延缓衰老目的。
2.4.3SLWE对HFF-1中MMP-1、MMP-9含量影响
MMP-1特异性降解Ⅰ型胶原蛋白,使得I、III型胶原比例下降,MMP-9作为一种明胶酶,可以继续降解MMP-1降解产物,导致皮肤胶原蛋白流失,衰老发生[32]。SLWE对HFF-1中MMP-1、MMP-9含量影响如图9所示。
如图9所示,与空白对照相比,SLWE可降低HFF-1中MMP-1含量,并存在一定剂量依赖性。体积分数为6%的SLWE水溶液可显著降低MMP-1含量(P<0.01),与体积分数为0.1%的SLWE水溶液相比,降幅达64.60%。但SLWE对MMP-9含量影响不明显,说明SLWE可通过抑制MMP-1有效缓解胶原蛋白的降解,但对缓解MMP-1降解产物的进一步降解作用不明显。
2.5SLWE对UVB致HFF-1损伤的保护作用
2.5.1建立UVB致HFF-1损伤模型的SLWE保护组
采用68mw/cm2剂量UVB辐照HFF-1建立细胞损伤模型,细胞活率低于60%,认定为UVB致HFF-1损伤模型构建成功(表4)。以SLWE(体积分数分别为6%、0.6%、0.3%、0.16%、0.08%、0.06%)水溶液保护HFF-1免受损伤,结果如表4所示。
如表4所示,OD值越大,表明CCK-8染色线粒体数越多,活细胞数目越多,保护作用越强。以空白组细胞活率为100%,UVB损伤组细胞活率为59%,具有极显著性差异(P<0.001),说明68mw/cm2剂量UVB对HFF-1有显著性损伤作用;与UVB损伤组相比,SLWE水溶液体积分数为6%、0.6%时,细胞活率分别为71%(P<0.001)、66%(P<0.05),具有显著性差异,而SLWE水溶液体积分数低于0.3%时,对UVB损伤HFF-1的保护作用不明显,因此,后续实验采用SLWE水溶液体积分数6%、0.6%、0.3%为测试样品。
2.5.2SLWE对HFF-1损伤保护组ROS、MDA、MMP-1和SOD的影响
采用荧光显微镜和荧光酶标仪方法检测HFF-1损伤保护组ROS荧光强度,结果如图10所示。
如图10所示,以UVB损伤组ROS含量为100%,测得空白组ROS含量为88%,说明经UVB辐射,HFF-1内ROS含量明显增多[33];随着SLWE水溶液体积分数增大,ROS含量呈梯度下降,当SLWE体积分数分别为0.3%、0.6%、6%时,HFF-1中ROS含量分别为98%、92%、87%,说明SLWE对UVB致HFF-1氧化损伤的保护作用呈剂量依赖性,且体积分数大于0.3%的SLWE水溶液可有效降低因UVB刺激产生的ROS,防止细胞产生氧化应激。
ROS上升会刺激细胞发生氧化应激[1],如激活基质金属蛋白酶表达,发生脂质过氧化从而生成MDA等物质,因此,测定MDA含量和MMP-1表达水平,可间接反映细胞损伤程度,而SOD作为衡量机体抗氧化能力大小的重要因素,可反映细胞消除ROS的能力。SLWE对HFF-1损伤保护组MDA、MMP-1和SOD的影响如图11所示。
如图11所示,UVB损伤组HFF-1中MDA和MMP-1含量显著提高,SOD酶活力显著降低,说明UVB对HFF-1有明显损伤作用,同时影响HFF-1清除ROS。与UVB损伤组相比,体积分数为6%的SLWE水溶液可显著降低MDA含量,抑制MMP-1表达,提升SOD活力,并且呈现一定的剂量依赖性,说明SLWE对UVB致HFF-1损伤具有保护作用,同时可显著提高细胞抗氧化能力,缓解氧化应激造成的细胞损伤。
3结论
SLWE富含槲皮素、表儿茶素、VC等多种具有显著抗氧化性成分,且具有良好的自由基清除能力。体积分数大于0.3%的SLWE水溶液可有效去除细胞中的ROS,同时缓解由外源条件,如光照(UVB)等造成的细胞损伤,提高HA含量,提升皮肤含水量,为皮肤提供有利的组织环境;此外,SLWE具有促进HYP和COLI表达,增加胶原含量,抑制MMP-1表达,减少胶原分解的功效,同时阻止胶原发生糖化反应交联变黄。因此,SLWE具有多角度全方位维持皮肤弹性、结构和含水量,减少皮肤暗淡、松弛和皱纹。SLWE可作为一种良好的抗氧化和延缓衰老功效原料,可应用于食品、保健品、化妆品等相关领域,促进草莓叶“废物利用”,挖掘草莓经济效益。