FaRALF1基因调控‘红颜’草莓果实成熟的功能分析
摘要多肽信号广泛存在于高等植物体内，并对植物的生长发育和果实成熟起重要的调控作用，为探究多肽信号调控植物果实成熟机制，本研究以八倍体‘红颜’草莓为试验材料，通过生物信息学技术在草莓全基因组中鉴定出一类植物多肽信号家族RALF(Rapidalkalinizationfactors)，并根据染色体上的定位命名将其为FaRALF1-FaRALF9，通过分析FaRALFs基因家族成员在草莓果实不同发育时期的表达差异，以及其对脱落酸(ABA)、生长素(IAA)、油菜素内酯(BR)、蔗糖处理(Suc)的响应特征分析，初步推测家族成员FaRALF1可能参与调控草莓果实成熟。通过构建FaRALF1基因的超表达FaRALF1-OE(OverExpression)和RNA干扰FaRALF1-RNAi(RNAinterference)载体瞬时侵染大绿时期的草莓果实，通过体视荧光显微镜观察侵染5d后草莓果实的荧光标签和成熟表型，并通过qRT-PCR(Quantitativereal-timePCR)分析基因表达量，其中FaRALF1-OE促进草莓果实成熟;相反，FaRALF1-RNAi抑制果实成熟。本研究初步表明植物多肽信号家族成员FaRALF1基因参与调控‘红颜’草莓果实成熟，且表达量与果实成熟程度呈正相关，为研究植物多肽信号调控果实成熟机理提供了基础。
本文源自分子植物育种 发表时间：2021-03-18《分子植物育种》(双月刊)创刊于2003年，由海南省生物工程协会主办。是一份为转基因育种、分子标记辅助育种及常规育种服务的国际化科学期刊，内容涉及了水稻、小麦、玉米、油菜、大豆、棉麻、薯类、果树、蔬菜、花卉、茶叶、林草等多方面，主要是刊登分子遗传育种理论、分子育种方法、分子育种研究动态以及优良种质培育的科学论文报道。主要栏目：专题评述、研究论文、研究报告、专题介绍、论文简报、新基因、新种质、新品种、新思路、新技术、新方法、术论坛与信息。
关键词草莓;快速碱化因子;果实成熟
植物自身代谢产生了多种植物激素和多肽信号，这些信号分子形成的网络协同调控植物的各种生理活动(Pearceetal.,2001;VanstraelenandBenková,2012;HirakawaandSawa,2019)。目前已研究较深入的植物激素主要包括生长素(Auxins)、细胞分裂素(Cytokinins)、赤霉素(gibberellin,GA)、脱落酸(abscisicacid,ABA)、乙烯(Ethylene)等，但多肽信号分子的发现至今仅有30年，其对于植物生长发育和果实成熟的研究较少且很多相关的分子机制尚不清晰。多肽信号分子主要包括Systemin、ENOD40(EARLYNODULIN40)、PSK(Phytosulfokine)、CLV3(CLAVATA3)、SP11/SCR(S-locusprotein11/S-locuscysteine-richprotein)和RALF等六类(VanstraelenandBenková,2012)。其中，RALF是植物多肽超级大家族中的一个亚家族，在植物中广泛存在，已经在51种植物中得到鉴定(CampbellandTurner,2017)，其广泛分布在植物的营养和生殖器官，包括根、茎、叶、种子和花粉管等参与多种不同的生理活动调控(MurphyandDeSmet,2014)，主要包括细胞膨大(Harutaetal.,2014)、侧根发育(MurphyandDeSmet,2014)、根毛生长(Wuetal.,2007)和花粉管伸长与受精(Geetal.,2017)等。RALF家族包含了大量成员(Sharmaetal.,2016)，但只有极少数RALF成员被鉴定出来，而对RALF信号系统核心元件的鉴定和功能研究更是少之又少。目前，只有拟南芥AtRLK1L家族的3个成员FER、BUPS1和BUPS2作为RALF信号分子的受体被鉴定和证实(Harutaetal.,2014;Geetal.,2017;Du,2016)。根据已有研究，RALF信号在调控植物生长发育的功能研究中取得了一定进展，但其调控果实成熟相关的功能及机理，特别是在信号系统中起调控作用的关键蛋白及其作用的分子机制仍不清楚。
草莓作为典型的非呼吸跃变型果实，已经成为果树分子生物学研究的模式材料(Jiaetal.,2011)。本研究在实验室前期研究基础上，从八倍体‘红颜’草莓(Fragaria×ananassa‘Benihoppe’)鉴定出植物多肽信号家族RALF(Rapidalkalinizationfactors)，初步探究植物多肽RALF信号是否参与调控草莓果实成熟，为深入挖掘调控草莓果实发育和品质形成的基因资源奠定基础，对于通过基因工程创制草莓新品种具有重要意义。
1结果与分析
1.1‘红颜’草莓FaRALF家族鉴定
通过生物信息学技术，在草莓全基因组鉴定出9个RALF家族成员(表1)。根据在染色体的物理位置分别命名为FaRALF1-FaRALF9(图1)，第1、6、7条染色体分别有1个家族成员，第2、3、4条染色体分别有2个家族成员，而第5条染色体没有发现家族成员。从FaRALFs蛋白基本信息中可知，FaRALF家族成员开放阅读框长度在102~134之间，其中FaRALF9氨基酸数最多，为134个;分子量在11287(FaRALF3)~15460kD(FaRALF9)之间;等电点在6.7~9.82之间，其中，FaRALF4为弱酸性蛋白，其余成员均为碱性蛋白;亲水系数的范围从-0.673到-0.008，其中亲水性最强的为FaRALF6;不稳定指数从29.93-54.70，其中最不稳定的为家族成员为FaRALF2，而最稳定的为FaRALF7。FaRALF家族成员的理化参数的获取为深入研究家族成员蛋白表达、纯化和功能提供依据。
1.2草莓FaRALF家族对激素的响应特征
为探究FaRALF家族对果实成熟的调控功能，本研究选择已被证实为对草莓果实成熟具有调控功能的4种激素信号物质(ABA,IAA,BR和Suc)来处理大绿时期的草莓果实。结果显示(图2)，RALF家族成员对激素处理响应显著。IAA、BR和Suc处理下，RALF家族成员基因表达量明显增加，尤其是对BR响应比较剧烈，其中，FaRALF8基因表达量是对照的13.21倍。但是，FaRALF2和FaRALF3在ABA处理下，其表达量均出现降低。因此，该结果也暗示着FaRALF家族可能参与调控草莓果实成熟。
1.3草莓FaRALF家族在果实不同发育时期的表达特征为研究FaRALF家族在草莓果实不同发育时期的表达特征，将草莓果实发育分成5个时期，即，小绿期(smallgreen,SG)、中绿期(mediumgreen,MG)大绿期(biggreen,BG)、转色期(turning,TN)、全红期(fullyred,FR)。结果显示(图3)，FaRALF家族基因表达量在果实成熟过程中表现出不同的变化规律。FaRALF1表达量在果实发育前期缓慢增加，转色期后迅速增加，FaRALF4、FaRALF6、FaRALF7和FaRALF8表达量呈现出先增加后降低的趋势，而FaRALF2、FaRALF3、FaRALF5和FaRALF9则随着果实发育而降低，其中，FaRALF5在中绿果期后几乎不表达，FaRALF9的表达量降低最剧烈，小绿果期的表达量是全红期的512.1倍。这些结果可能暗示FaRALF家族成员在草莓果实成熟进程中发挥着不同的作用。
1.4FaRALF1调控草莓果实成熟的功能分析
为研究FaRALF家族调控草莓果实成熟的功能，本研究以筛选出与草莓成熟相关度最高的家族成员FaRALF1为研究对象，通过构建携带FaRALF1基因的干扰、过表达载体瞬时侵染草莓果实，分析果实表型及对荧光标签进行观察。结果显示(图4)，5d后在体式荧光显微镜下均能观察到DsRed红色荧光，说明FaRALF1-OE和RNAi载体均成功转化到果实内。空载处理的对照果实部分变红，FaRALF1-RNAi干扰处理果实只有少量变红，而FaRALF1-OE过表达处理果实则全部变红，表明FaRALF1-RNAi抑制草莓果实成熟，而FaRALF1-OE则促进草莓果实成熟。荧光定量PCR检测结果进一步表明(图5)，FaRALF1-OE过表达处理基因表达量是对照的4.11倍，而FaRALF1-RNAi干扰处理基因表达量是对照的0.15倍。以上结果说明，FaRALF1正调控草莓果实成熟。
2讨论
本研究在八倍体草莓基因组鉴定出9个RALF家族成员，并根据染色体物理定位进行命名。鉴定家族成员在草莓果实不同时期表达量以及对于生物胁迫的响应程度。对FaRALF1进行过表达、RNA干扰瞬时转化果实处理，并从表型、基因层面进行验证，初步认为FaRALF1参与正调控草莓果实发育成熟。
众所周知，不论是呼吸跃变型果实还是非呼吸跃变型果实，植物激素具有微量高效的特点，并在果实成熟过程中具有重要的调控作用。特别是ABA(Jiaetal.,2013;Liaoetal.,2018)、IAA(Fengetal.,2019)等已被证实参与果实成熟的调控过程。本研究发现RALF家族对ABA的响应与对照果实具有显著性差异，大部分成员在ABA处理时基因表达量升高，只有FaRALF2/3在ABA处理下，表达量降低。因此，该结果也预示RALF家族可能参与调控草莓果实成熟。且拟南芥中RALF基因在不同器官中存在着不同表达谱的研究结果表明，随着不同的发育阶段以及植物受到的生物、非生物胁迫，RALF具有广泛的表达特征(MacintoshandGreen,2001)。本研究对于生物胁迫的处理结果符合前人研究结果(图2)：RALF家族对激素处理均表现出明显的响应，在IAA、BR和Suc处理下相关基因的表达量明显增加，且对BR响应尤为剧烈，其中，FaRALF8基因表达量是对照果实中的13.21倍。本实验室在前期研究中也发现BR参与调控草莓果实早期成熟进程(Chaietal.,2013)。这表示RALF家族可能通过BR信号转导路径参与调控果实成熟。
此前有研究表明RALF家族成员可能参与草莓不同组织和器官的发育，不同的成员可能对不同发育时期的果实产生影响，特别是对于FvRALF1，FvRALF2，FvRALF5，FvRALF10和FvRALF12可能对瘦果期和花托期果实发育有影响(Zhangetal.,2020)。如图所示，RALF家族成员在草莓果实中均有表达，并且随着果实成熟进程表现出不同的变化规律(图3)。RALF4/6/7/8表达量随着果实成熟进程呈现出先增加后降低的趋势，RALF2/3/5/9随着果实成熟进程而降低，而FaRALF1表达量在果实发育前期缓慢增加，转色期后迅速增加。这些结果与前人研究结果相一致，也表明FaRALF家族成员在草莓果实成熟进程中发挥着不同的作用。在此基础上，为进一步验证FaRALF1参与草莓果实发育成熟的功能，本研究利用瞬时转基因技术处理八倍体‘红颜’草莓果实。结果均能观察到DsRed红色荧光(图5)，说明FaRALF1-OE和FaRALF1-RNAi载体均在成功转入果实细胞内并在果实体内成功表达。由瞬时转基因成功后的果实表型可以发现FaRALF1-OE促进草莓果实成熟，而FaRALF1-RNAi则抑制草莓果实成熟。以上结果表明，FaRALF1正调控草莓果实成熟。
模式植物和主要农作物中已经有研究表明，植物的生长发育过程是由植物分泌的多肽信号分子和非蛋白质类的信号分子共同形成的信号网络协同调控(HirakawaandSawa,2019)。本研究结果表明(图2)：RALF家族成员对于ABA、IAA、蔗糖等非蛋白质类信号响应敏感。尽管目前未在草莓果实的发育成熟中揭示出RALF的信号转导通路，但有报道指出RALFs还参与调控植物响应生物胁迫和非生物胁迫应答，RALF通过其受体FERONIA发挥生物学功能，在对于受体FER的磷酸化程度上表现与ABA一致(Guptaetal.,2010;Atkinsonetal.,2013)。草莓中也鉴定出一个重要的细胞质蛋白激酶FaRIPK1，通过ABA信号转导路径参与调控草莓果实成熟(Houetal.,2018)。同时拟南芥中的研究表明，某些RALF成员可以和FER结合，而FER和细胞质蛋白激酶RIPK结合形成激酶复合物转导RALF信号抑制根系生长发育(Du,2016)。尽管RALF信号调控拟南芥根系生长发育和调控草莓果实成熟的作用不同，但是RALF信号转导的分子作用机制应该是相似的。
本研究在前人研究的基础上进一步验证了FaRALF1的功能，但并未对所鉴定的9个家族成员均进行功能载体构建以及瞬时转化的实验;仅对果实进行了不同时期基因表达量测定，相比而言，不同部位的时空表达测定更具有代表性;对于本研究更深入的结果分析及后续的研究仍存在一定局限性。但结合本研究与前人研究结果，该研究对于揭示多肽信号参与草莓果实发育成熟以及深入挖掘草莓成熟发育相关基因具有重要意义;针对目前人工栽培种草莓异花授粉以及易感染真菌病害的特点，多肽信号介导的调控机制对于提高栽培种草莓品质和创制新品种草莓提供了重要参考价值。
3材料与方法
3.1植物材料
试验材料为北京农学院组织培养中心种植八倍体草莓‘红颜’(Fragaria×ananassa‘Benihoppe’)，温度为20℃~26℃、相对湿度为70%~90%、光照14h、黑暗10h。
主要试剂包括RNA提取试剂盒(OMEGA)、BP、LR反应试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒(Axygen)等，均购于北京华佰泰生物技术有限公司;反转录试剂盒、实时荧光定量试剂盒、T1Simple、Trans1-T1PhageResistant感受态细胞购买与北京全式金生物技术有限公司;农杆菌GV3101感受态细胞购于北京华越洋生物技术有限公司。
3.2目的基因的克隆
将‘红颜’草莓果实于液氮中保存，按照OMEGA试剂盒要求提取总RNA，反转录合成cDNA第一链，使用NEB公司Q5高保真酶进行PCR克隆目的基因，所用引物序列已列出(表2)。
3.3不同发育时期基因表达量测定
草莓果实成熟期分五个时期，即：小绿期(smallgreen,SG)中绿期(mediumgreen,MG)大绿期(biggreen,BG)、转色期(turning,TN)和全红期(fullyred,FR)。基因表达量分析方法参照文献(柴叶茂等,2011)。
3.4载体构建
通过Gateway体系构建FaRALF1基因的过表达(pH7FWG2-RR-293-DsRed)及沉默载体(pK7GWIWG2(II)RR-277-DsRed)，功能载体均携带独立表达的DsRed荧光标签;引物序列见表2。具体方法参照文献(谷晓娇和沈元月,2020)。
3.5瞬时转化
将构建好的载体转化到农杆菌GV3101中，挑取单克隆菌株活化。将瞬时侵染处理后的草莓果实置于智能人工气候箱中，温度为25℃，相对湿度为80%，黑暗处理5d。具体方法参照文献(王树芳,2018)。
3.6激素处理
激素处理包括：25℃条件下：100μmol/L脱落酸(ABA)处理果实6h，500μmol/L生长素(IAA)处理果实6h，100mmol/L蔗糖(Suc)处理果实6h，100μmol/L油菜素内酯(BR)处理果实8h，对照处理(LB培养液,6h)保持在25℃和100%相对湿度。选择大绿期的果实后处理。具体方法参照文献(卢文静,2018)
3.7FaRALF家族生物信息学分析
草莓RALF家族在三个公共数据库中鉴定：国家生物技术信息中心，草莓基因组浏览器和PLAZA。草莓RALF家族蛋白理化参数分析通过ExPasy网站提供的工具计算推定蛋白基本信息。具体方法参照。