生鲜面优势腐败菌的分离鉴定及致腐能力分析

　　摘 要：为研究生鲜面优势腐败菌及致腐能力大小，通过形态学鉴定筛选优势腐败菌，再利用生理生化手段和 16S rDNA 序列分析法手段进行优势腐败菌鉴定。以感官评分、酸度、 pH 和菌落总数为评价指标，确定优势腐败菌的致腐能力大小。鉴定结果表明：引起生鲜面腐败的主要腐败菌为细菌，经生理生化鉴定和 16S rDNA 序列鉴定可知优势腐败菌分别为枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌。致腐能力结果表明：通过对不同贮藏时间生鲜面的感官评分、酸度、pH 和菌落总数进行综合评价，发现 3 株优势腐败菌的致腐能力：枯草芽孢杆菌>蜡状芽孢杆菌>地衣芽孢杆菌。

　　本文源自保鲜与加工 发表时间：2021-02-23《保鲜与加工》杂志是由国家农产品保鲜工程技术研究中心主办的全国唯一以农产品保鲜与加工为主要内容的技术类科技期刊，也是中国农产品保鲜工程协会、中国农学会贮藏加工分会、中国园艺学会采后科学技术分会会刊，2000年创刊。十年来，我们始终坚持办刊宗旨，全面推行以质量为中心的办刊机制，追踪国际同类研究发展前沿，以市场为导向，主要设置了专家论坛、保鲜研究、加工研究、专题论述、技术指南、科技前沿、政策法规、行业资讯、科普沙龙等栏目，突出理论与实践相结合，提高学术水平与科技普及技术指导兼顾的特色，每年按期发行期刊6期，共计3万册，遍及全国除港澳台外的31个省市自治区，为我国农产品保鲜与加工行业的技术进步及其相关技术产品产业化开发和科技普及起到了积极的促进作用。

　　关键词：生鲜面;优势腐败菌;分离;鉴定;致腐能力

　　面条作为我国人们的传统主食之一，有着悠久的历史，且制作便捷，含有丰富的维生素、碳水化合物、蛋白质，和微量元素[1-2]。面条主要分为生鲜面、挂面、方便面等，其中生鲜面由于即做即食，口感筋道爽滑，颇受人们的喜爱，在我国占据很大的消费市场。随着我国食品工业的发展，以及人们对食物越来越高的要求，对生鲜面的保水性、保存性、不宜腐败性等提出了更高的要求。但由于生鲜面本身含水量高，容易因微生物的滋生而腐败变质，从而造成原料的大量浪费和高昂的运输成本[3-5]。因此，如何防止微生物对生鲜面品质的损坏是提高生鲜面品质和降低贮藏成本的重要研究方向之一。

　　目前，国内外对生鲜面中的腐败菌有一定的研究报道。许玉慧等[6]在对即食湿面条的腐败微生物的分离中得出，导致湿面条腐败变质的微生物为细菌，其主要为枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌。周其中[7]在生鲜湿面保藏技术的研究中发现导致腐败的主要微生物为细菌和霉菌，另外也鉴定出了 7 个霉菌属。黄斌等[8]对生鲜面进行了危害分析和关键环节控制点的研究，同时进行危害分析并建立关键控制点。刘增贵等[9]的研究表明，生鲜面条在 30 ℃储藏条件下，微生物迅速增殖，面条颜色逐渐变黄，得出微生物是造成面条劣变的重要因素。但目前对即食湿面条中腐败微生物的相关研究报道相对较少，李昌文等[10]对即食湿面条的保鲜进行了研究，但未对腐败微生物进行分离鉴定，而李运通等[11]指出细菌是导致高水分面制品腐败的主要微生物，会产生复杂的物化反应，从而导致面条品质变质。

　　本研究通过形态学鉴定筛选生鲜面中的优势腐败菌，再利用生理生化手段和 16S rDNA 序列分析法手段对生鲜面中的优势腐败菌进行鉴定。同时，以感官评分、酸度、pH 和菌落总数为评价指标，综合评价优势腐败菌对不同贮藏时间生鲜面的致腐能力，为生鲜面的工业化生产、商品流通等提供理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料与试剂

　　小麦粉：金龙鱼高筋麦芯粉;食用盐：河南省卫群多品种盐有限公司;三氯甲烷、氯化钠、革兰氏染剂、氢氧化钠、丙酮、30%过氧化氢溶液、V-P 试剂、硝酸盐、吲哚、营养琼脂培养基、平板计数琼脂培养基、孟加拉红培养基：北京奥博星生物技术有限公司。

　　1.2 仪器与设备

　　YP-N 型电子分析天平，上海精密仪器仪表有限公司;超净工作台，苏州净化设备有限公司;立式压力蒸汽灭菌器，上海博讯医疗生物仪器股份有限公司;SPX-250B-Z 型生化培养箱、SW-CJ-1BU 超净工作台，上海博讯医疗生物仪器股份有限公司;PHS 25 型 pH 计，上海雷磁仪器厂;WD-9413B 型凝胶成像分析系统，北京六一生物科技有限公司;DNA 提取试剂盒，西安擎科创新生物科技有限公司。

　　1.3 方法

　　1.3.1 生鲜面的制作

　　面粉、食盐、水(质量比 100︰1︰39)→和面(慢速档搅拌 5 min，中速档搅拌 2 min)→熟化(室温静置 15 min)→压延(在压辊间距 2、1.8、1.6、1.4 mm 处各对折压片 5 次，形成厚度为 1.4 mm 的面片)→切条→脱水(120 ℃烘干 1 min)→装袋

　　1.3.2 生鲜面的腐败处理

　　将无菌生鲜面在 25 ℃条件下进行储藏，直至腐败变质。

　　1.3.3 微生物计数

　　菌落总数测定：参照 GB/T 4789.2—2016 《食品安全国家标准 食品微生物检验 菌落总数测定》;霉菌及酵母菌测定：参照 GB/T 4789.15—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数》。

　　1.3.4 生鲜面腐败菌的分离纯化

　　在无菌操作环境下，称取已腐败生鲜面样品 1 g，放入已灭过菌的研钵中，把生鲜面研碎加入 9 mL 无菌水后再次进行充分研磨，随后取 1 mL 生鲜面的悬浊液进行 10 倍系列梯度稀释，选择 4 个合适的稀释度各吸取 1 mL 涂布平板到营养琼脂培养基上，每个浓度下设3 个平行实验，同时做好空白对照。及时将涂布完成的培养基倒平板同时放入 37 ℃的生化培养箱中培养 48 h±2 h。待培养基上的细菌长出，观察培养基表面的菌落生长状况，确定其优势腐败菌，做好标记。将分离出的菌落平板划线，反复分离纯化，进行低温保藏待用。

　　1.3.5 优势腐败菌的鉴定

　　1.3.5.1 生理生化鉴定

　　参考《常见细菌系统鉴定手册》采取菌落观察等方法对实验中分离得到的菌株进行初步鉴定;通过硝酸盐还原、接触酶、氧化酶、葡萄糖、甘露醇、木糖发酵实验、V-P 实验、明胶水解、淀粉水解、柠檬酸盐利用、丙酸盐利用、吲哚实验、耐盐性实验、耐热性等生化鉴定实验对分离的菌株进行生化鉴定。

　　1.3.5.2 分子生物学鉴定

　　选取在适宜条件下培养了 24 h 左右的腐败菌制成菌悬液，10 000 r/min 离心 10 min 后弃去上清液，然后加入 100 μL ddH2O 制得模板 DNA。PCR 扩增反应体系包括: 模板 DNA 2 μL，引物 27 F 1 μL，引物 1541R 1 μL，Taq PCR Master Mix(2×)25 μL，ddH2O 补至 50 μL。 PCR 反应条件：95 ℃预变性 5 min，95 ℃变性 60 s，58 ℃复性 60 s，72 ℃延伸 90 s，共 30 个循环;72 ℃延伸 5 min;4 ℃保存。取 5 μL PCR 扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，随后将扩增产物在西安擎科生物技术有限公司进行测序鉴定，并登录 NCBI 网站，与数据库已知序列进行比对，获得相似性较高的菌株序列，使用 MEGA 5.0 软件，构建系统发育树。

　　1.3.6 生鲜面腐败菌的腐败能力测定

　　生鲜面经包装密封后紫外杀菌，得到无菌生鲜面。首先，将分离出的供试优势菌接种于营养琼脂培养基中后放入生化培养箱中于 37 ℃下培养 48 h，无菌操作下将接种环于酒精灯下充分灼烧后分别挑取一定量几种菌株并加入 225 mL 的无菌水，适当的调整菌悬液浓度，每挑一次菌都要将接种环进行充分的灼烧以防混入杂菌。接着，分别将无菌生鲜面置于供试菌株菌悬液以及无菌水中浸泡 30 s 后拿出，用无菌包装密封袋重新包装后即为接种处理过的生鲜面，同时以无菌水浸泡 30 s 并以无菌包装的生鲜面为空白对照。最后，将所有样品放回入恒温箱中 25 ℃密封保存。每隔 6 h 定时取样，对采集的样品进行感官评价、酸度值、 pH 值和菌落总数等理化指标的测定，以评价几种不同的菌株对生鲜面的致腐能力。

　　1.3.6.1 生鲜面菌落总数测定

　　参照 1.3.3 微生物计数中的菌落总数测定。

　　1.3.6.2 生鲜面 pH 的测定

　　参照 GB 5009.237—2016《食品安全国家标准 食品 pH 值的测定》进行测定。

　　1.3.6.3 生鲜面酸度值的测定

　　参照 GB5009.239—2016《食品安全国家标准 食品酸度值的测定》进行测定。

　　1.3.7 生鲜面的感官评价

　　通过查阅任顺成等[12]和张婉[13]的面条感官评分标准。由感官评价小组(5 位经过专业培训的人员组成)对生鲜面的质地、色泽、气味、是否酸败等指标进行评价。感官评价采用 10 分制，当评分低于 5 分(包括 5 分)时，生鲜面若出现酸味或霉变，即不能食用。评价指标体现见表 1。

　　1.3.8 数据处理

　　数据采用 3 次平行试验的平均值，结果用平均值±标准偏差表示。采用 Origin 8.0 软件进行绘制数据图。使用 MEGA 5.0 软件构建系统发育树。

　　2 结果与分析

　　2.1 生鲜面微生物计数

　　将腐败的面条接种在营养琼脂培养基、孟加拉红培养基上，经培养后，各培养基的生长情况如表 2 所示。

　　由表 2 可知，营养琼脂培养基上生长出较多适宜细菌的微生物，大大超过了 NY/T 1512-2007《绿色食品 生面食、米粉制品》[14]中生面食菌落总数应≤3×105 CFU/g 的要求。孟加拉红培养基作为主要培养霉菌、酵母菌的培养基上几乎没有微生物，由此可知导致生鲜面腐败的优势腐败微生物主要是细菌。可见，细菌是导致生鲜面腐败的主要因素，主要是由于生鲜面含水量较高，营养丰富，环境适宜菌群生长较快，最终导致货架期较短。

　　2.2 优势腐败菌的分离和筛选

　　2.2.1 各种腐败菌落特征及比例

　　图 1 为 1、2、3 号菌的菌落特征图，表 3 为各种腐败菌落的特征及比例。由表 3 可知， 1 号菌在培养基中的比例为 39.25%，2 号菌为 30.45%，3 号菌为 21.34%，三株菌占所有腐败菌的 91.04%，表明这三株菌为生面条中主要的优势腐败菌。

　　各腐败菌菌株的生理生化特征如表 4 所示，由表 4 结果与系统手册初步对比可知，DX 为枯草芽孢杆菌、DY 为地衣芽孢杆菌、DZ 为蜡状芽孢杆菌，后续还需进行 16S rDNA 序列鉴定以进一步确定。

　　2.2.2 16S rDNA 序列测定

　　将分离得到的 3 株优势菌种 DX、DY、DZ，进行 16S rDNA 测序鉴定。以 3 株优势腐败菌株的 DNA 为模板，进行 PCR 扩增，并做凝胶电泳检测。

　　3 株优势菌株 16S rDNA 的 PCR 扩增电泳图谱如图 2 所示。由图 2 可见，扩增产物在 1 500 bp 附近可见清晰明亮条带。将 PCR 产物送至西安擎科生物技术有限公司进行测序，将测序结果在 NCBI 中比对，获得相似性较高的菌株序列，使用 MEGA5.0 软件，构建系统发育树。

　　3 株优势菌株的 16S rDNA 序列同源性系统发育树如图 3 所示。由图 3 可知，所有序列与已知的同源性均在 97%以上，说明鉴定结果可靠。经分子鉴定后，3 株菌株分别为：DX 为枯草芽孢杆菌、DY 为地衣芽孢杆菌、DZ 为蜡状芽孢杆菌。

　　2.3 优势致腐对生鲜面品质的影响

　　将优势腐败菌接种在新鲜的生鲜面上，来探究不同贮藏时间(0、6、12、18、24、30)对生鲜面品质的影响。

　　2.3.1 在不同贮藏条件下腐败菌对感官评分的影响

　　感官评价法目前是食品品质评价的主要方法[15~16]。在 25 ℃贮藏条件下接种腐败菌的生鲜面感官评分的变化趋势如图 4 所示。由图 4 可知，在贮藏期间，感官评分起始为 9.10 分，随着贮藏时间的增加，总体都呈下降趋势，在贮藏 12 h 后面条外观明显变暗，面条质地发黏，伴随有腐烂变质的气味，在贮藏 30 h 时感官评分达到最低，且不同微生物对生鲜面感官评价的影响程度是不同的。同时，随着贮藏时间的延长，感官评价下降的程度越来越显著，其中接种 DX 的生鲜面的变质程度最为显著，在贮藏 30 h 时感官评价达到最小值，即 4.20分，其次是 DZ 和 DY，最小值分别为 4.50 分和 5.10 分，这与赵宏强等[17]研究的冷藏鲈鱼片中优势腐败菌的感官评分变化趋势基本一致。这主要是由于不同微生物的生长速度和致腐能力不同，进而造成生鲜面的腐败程度也不同。接种不同微生物的生鲜面之间呈现显著性差异(P<0.05)。

　　2.3.2 在不同贮藏条件下腐败菌对生鲜面酸度的影响

　　酸度的变化是判断生鲜面腐败变质的重要因素。在 25 ℃贮藏条件下接种腐败菌的生鲜面酸度的变化趋势如图 5 所示。由图 5 可知，在贮藏期间，酸度起始为 0.80 mL/10 g，随着贮藏时间的增加，三种生鲜面的酸度总体都逐渐上升，在贮藏 18 h 时，酸度上升略微平缓，在贮藏 30 h 时达到最大值。接种不同微生物的生鲜面酸度值之间呈显著性差异(P<0.05)。在接种的三株优势菌株中，DX 的酸度值最大，在贮藏 30 h 时达到最大值，即 4.46 mL/10 g，其次是 DZ 和 DY，酸度值分别达 3.90 mL/10 g 和 3.70 mL/10 g。空白组的酸度值整体低于接种优势菌株的样品组的酸度值。Li M 等[18]研究表明，酸度与微生物的增长有显著的正相关关系，主要是由于在贮藏过程中，微生物的生长代谢产物会造成生鲜面酸败。

　　2.3.3 在不同贮藏条件下腐败菌对生鲜面 pH 的影响

　　pH 的变化是判断生鲜面腐败变质的关键因素。25℃贮藏条件下接种腐败菌的生鲜面 pH 的变化趋势如图 6 所示。由图 6 可知，在贮藏期间，pH 起始为 6.72，随着贮藏时间的增加，接种 DX、DY 和 DZ 优势腐败菌的生鲜面的 pH 值都逐渐降低，在贮藏 18 h 时，pH 值下降略微平缓，在贮藏 30 h 时 pH 值达到最小值。刚制备出的生鲜面的 pH 在 6.50 附近，此条件下非常适合微生物的生长[19];随着贮藏时间的延长，接种 DX 菌的生鲜面的 pH 下降速率最快，在贮藏 30 h 时达到最小值，即 pH=5.07，其次是 DZ，最后是 DY，pH 分别为 5.24 和 5.58。此外，未接种腐败菌的空白组的 pH 都略高于其他三种，三株优势腐败菌之间对生鲜面的影响呈显著性差异(P<0.05)。引起生鲜面 pH 值下降的主要原因在于在贮藏期间由于微生物的大量繁殖，使得生鲜面中的淀粉等碳水化合物被充分利用，产生了大量的有机酸等酸性底物和代谢底物，使得生鲜面的 pH 不断下降[20]。

　　2.3.4 在不同贮藏条件下腐败菌对生鲜面菌落总数的影响

　　微生物的生长繁殖所产生的代谢底物是引起生鲜面腐败变质的主要原因之一。其最明显的特征就是生鲜面中菌落总数的变化，是品质变化的指标之一[21~22]。在 25 ℃贮藏条件下接种腐败菌的生鲜面菌落总数的变化趋势如图 7 所示。由图 7 可知，在贮藏期间，菌落总数起始为 2.86 lg(CFU·g -1 )，随着贮藏时间的增加，菌落总数总体都呈现上升的趋势，其中接种 DX 菌的变化最为显著，在贮藏 30 h 时达到最大值，即 7.77 lg(CFU·g -1 )，高于其他三组，其次是 DZ，最后是 DY，菌落总数最大值分别为 6.78 lg(CFU·g -1 )和 6.62 lg(CFU·g -1 )，这与高磊等[23]研究的冷鲜鸡腿肉中优势腐败菌的菌落总数变化趋势基本一致。其中造成三组不同的主要原因可能是由于每种微生物的生长代谢速度和致腐机制的不同，造成菌落总数不同，其结果与微生物对生鲜面的感官评分、酸度以及 pH 的影响大致相同，造成了生鲜面品质的劣变。不同菌株的生长情况会随着贮藏时间呈现显著差异(P<0.05)，贮藏后期因为酸类、胺类等代谢产物的逐渐增多，又会反过来抑制微生物的生长[24]。

　　3 结论

　　本试验通过形态学鉴定筛选出生鲜面中的优势腐败菌，再借助生理生化手段和 16S rDNA 序列分析法手段对菌群中占比较高且致腐能力较强的优势腐败菌进行鉴定，鉴定结果表明 3 株优势腐败菌分别为枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌。同时，将鉴定出的 3 株优势腐败菌回接到生鲜面中，以不同贮藏时间生鲜面的感官评分、酸度、pH 和菌落总数为指标，综合评价优势腐败菌对生鲜面致腐能力的大小。结果表明 3 株优势腐败菌的致腐能力：枯草芽孢杆菌>蜡状芽孢杆菌>地衣芽孢杆菌。这为生鲜面的保鲜贮藏提供了理论依据，也为生鲜面产业化远距离运输降低运输费用提供了参考。