左归丸对去势大鼠钙转运通路相关蛋白的影响
〔摘要〕 目的 探討左归丸去势大鼠骨密度和骨、肾组织中钙转运通路相关蛋白的影响。方法 选取48只雌性SD大鼠，随机分为正常组，假手术组，模型组，西药组，中药低、高剂量组。除假手术组和正常组，其余组切除大鼠卵巢，造模成功后3个月进行各组干预。3个月后处死大鼠，检测大鼠骨密度(BMD);Western blotting法检测钙转运通路(肾组织)蛋白表达;免疫组化检测去势大鼠骨组织中新型上皮钙通道5(TRPV5)蛋白的表达。结果 与模型组相比，左归丸高剂量组与西药组大鼠骨密度均有改善(P<0.05);与假手术组比较，模型组各蛋白表达均有不同程度下降(P<0.01，P<0.05);尼尔雌醇和左归丸均能不同程度上调去势大鼠肾组织中TRPV5蛋白、钠钙交换器(NCX1)蛋白、钙结合蛋白-D28K(CaBP-D28K)和细胞膜钙汞(PMCA1b)蛋白表达，差异均具有统计学意义(P<0.05，P<0.01);免疫组化显示模型组较假手术组的TRPV5蛋白表达率增加(P<0.05)，而西药组和中药高、低剂量组较模型组蛋白表达率均下降(P<0.05)。结论 左归丸可通过上调肾钙转运通路中相关蛋白的表达和降低大鼠破骨细胞中TRPV5蛋白的表达，而发挥骨质疏松症治疗作用，肾、骨组织中钙转运过程相关蛋白可能成为骨质疏松症治疗的新方向、新靶点。
〔关键词〕 左归丸;去势大鼠;钙转运通路
《中文科技期刊数据库(文摘版)医药卫生》简称《医药卫生》是经国家新闻出版广电总局2009年4月8日批准的国家级电子学术教育期刊。
近几年骨质疏松的发病人数在我国已经明显上升，在60～70岁阶段，约33%的女性和20%的男性患有该疾病，骨质疏松流行病对中老年人的生命安全、身体健康等形成一定的危害与威胁[1]。到2050年中国骨质疏松症或骨密度低的患者将达到2.12亿[2]，骨质疏松症归属于中医学“骨痿”“骨痹”范畴。中医学认为，肾主骨，肾虚是绝经后骨质疏松症发生的始动病机[3-4]，肾精盛衰直接决定机体生、长、壮、老、已的生命活动状态。而骨的生长发育状况也直接与肾精盛衰密切相关。左归丸是滋阴补肾、填精益髓的名方，实验研究证明，左归丸具有类雌激素作用，能促进成骨细胞增殖，抑制破骨细胞的活性，维持二者的动态平衡，为中医“肾主骨”理论提供了有利的实验依据[5-6]。瞬时性受体电位通道(transient receptor potential，TRP)家族成员新型上皮钙通道5(TRPV5)是已知TRP中钙离子高选择性通道[7]，它在机体钙离子跨上皮转运方面发挥重要作用，参与调节整个机体的钙平衡。其介导的肾钙及骨钙转运过程与骨质疏松症的钙代谢紊乱有着密切的联系。本研究拟基于TRPV5介导的钙转运通路(肾组织、骨组织)探讨补肾经典方剂左归丸对骨质疏松症模型大鼠的疗效及作用机制。
1 材料
1.1 动物与药物
6月龄雌性SPF级SD大鼠48只，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，实验动物治疗合格证号43004700022760。左归丸配方：熟地黄24 g，山药12 g，枸杞12 g，山茱萸12 g，川牛膝12 g，菟丝子12 g，鹿胶12 g，龟胶12 g(由湖南省中医药研究院附属医院药剂科提供)，将药物水煎2次，合并滤液并浓缩致0.48 g(生药量)/mL(相当临床等效剂量)、1.92 g(生药量)/mL浓度的药液(相当于临床4倍量)。尼尔雌醇(购自上海医药(集团)有限公司新华联制药厂生产，国药准字：H31021647，规格2 mg/片)。
1.2 主要试剂
TRPV5(货号17322-1-ap)、CaBP-D28k(货号14479-1-ap)、NCX1(货号55075-1-ap)兔抗体均由(美国)proteintech公司提供;β-actin鼠抗体(货号60008-1-Ig)、PMCAIb(货号ab190355)兔抗体购自英国abcam公司;HRP goat anti-mouse IgG、HRP goat anti-rabbit IgG购自美国Proteintech公司;中性树胶购自Sigma公司;苏木素、PBS(PH7.2-7.6)和枸橼酸盐缓冲液购自Wellbio公司;二步法试剂盒、DBA试剂盒购自中杉金桥公司。
1.3 主要仪器
电泳仪(美国Bio-rad公司);蛋白酶抑制剂(德国Merck公司);台式高速冷冻离心机(中国深圳黑马公司);全自动酶标洗板机和多功能酶标分析仪(汇松公司);电泳槽(中国北京六一公司);转膜仪(中国北京六一公司);包埋机(常州中威电子仪器公司)、显微镜(Motic公司)。
2 方法
2.1 分组
将大鼠随机分成左归丸高剂量组、左归丸低剂量组、西药组、模型组、正常组及假手术组，每组8只。除假手术组和正常组，其余组均切除大鼠双侧卵巢复制绝经后大鼠骨质疏松动物模型。
2.2 造模
造模方法参照文献[8]，10%水合氯醛溶液对大鼠按0.33 mL/100 g体质量腹腔注射进行麻醉，将假手术组大鼠背部切开，进入腹腔，将卵巢找到，從其旁将一定量的脂肪(1 g左右)剪除。将切除卵巢组大鼠距脊柱外侧约1 cm与背部腋中线交叉部位的皮肤切开，腹腔打开，行两侧卵巢摘除术。伤口消毒7 d，观察伤口愈合情况。
2.3 给药剂量及方法
6组大鼠自由摄食、饮水，术后3月行活体骨密度(bone mineral density， BMD)检测验证模型复制成功，进行分组治疗干预。按70 kg的成人一天服用左归丸的生药量为105 g计算，人的给药量为1.5 g/(kg·d)，按照动物与人体表面积换算法，大鼠的临床等效给药量应为9.45 g/(kg·d)。每组大鼠的给药体积均为20 mL/(kg·d)，根据大鼠每日给药量与给药体积，制备左归丸低浓度煎剂为0.48 g生药/mL(相当于临床等效给药量)、左归丸高浓度煎剂1.92 g生药/mL(相当于临床4倍量)。
中药低剂量组给予左归丸低浓度煎剂(0.48 g/mL)，体积为20 mL/(kg·d);中药高剂量组给予左归丸高浓度煎剂(1.92 g/mL)，体积为20 mL/(kg·d);西药组给予尼尔雌醇1 mL/(kg·d)灌胃，使用前配成混悬液(浓度为0.167 mg/mL)，1次/周，其余时间予生理盐水20 mL/(kg·d)灌胃;假手术组和模型组的大鼠给予体20 mL/(kg·d)的生理盐水灌胃饲服。以上干预治疗均持续3个月。
2.4 肾样品和股骨头的标本制备
肾样品制备：剪取大鼠0.25 g肾组织，用冰预冷PBS洗组织，加入200 μL RIPA裂解液于匀浆器中反复研磨组织直至看不见组织块，以备Western Blot法检测大鼠肾组织中TRPV5介导的钙转运通路相关蛋白的表达。
股骨样品制备：将大鼠肌肉筋膜(附着在右后肢股骨)剔掉，以便进行大鼠样本骨密度检测。剪碎大鼠样本的暴露股骨(即大鼠左后肢股骨干骺端)，以备免疫组化测试骨样本骨组织中TRPV5蛋白的表达。