shRNA干扰URG11表达对骨肉瘤细胞恶性表型影响

　　[摘要] 目的 研究上調基因11(URG11)对骨肉瘤细胞(MG63)恶性表型的影响。

　　《东方食疗与保健》OrientalDiet-TherapyandHealthCare(月刊)是我国目前唯一的一份以介绍药膳食疗内容为主的科普性期刊，它填补了我国药膳食疗刊物的空白。

　　方法 用URG11短发夹RNA(shRNA)重组慢病毒感染细胞，以实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白免疫印迹(Western blot)检测干扰效果。四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)测定细胞增殖，流式细胞术测定细胞凋亡，Transwell检测细胞侵袭和迁移，Western blot检测裂解的半胱氨酸蛋白酶-9(Cleaved Caspase-9)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、裂解的半胱氨酸蛋白酶-3(Cleaved Caspase-3)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)和波形蛋白(Vimentin)等表达。

　　结果 URG11 shRNA重组慢病毒感染MG63细胞后，URG11表达下降，差异有显著性(F=181.200、97.307，P<0.001);细胞存活率、侵袭和迁移数量降低，细胞凋亡率升高，E-cadherin、Cleaved Caspase-9、Cleaved Caspase-3蛋白表达水平升高，Vimentin、MMP-9和MMP-2蛋白表达水平降低，差异均有显著性(F=28.064～625.516，P<0.05)。

　　结论 shRNA干扰URG11表达可抑制骨肉瘤细胞增殖、侵袭、迁移和上皮间质转化，并诱导细胞凋亡。

　　[关键词] 骨肉瘤;上调基因11;肿瘤侵润;细胞运动;细胞凋亡

　　骨肉瘤是一种好发于青壮年和青少年的恶性骨肿瘤[1]，其恶性表型如增殖、凋亡、侵袭等与细胞内异常表达基因有关[2]。上调基因11(URG11)是近年来发现的参与细胞运动、增殖等过程的基因[3]，且在胃癌、肝癌等中发挥癌基因作用，下调URG11肿瘤生长和转移能力减弱[4-5]。URG11在骨肉瘤组织中呈阳性表达，且与肿瘤病人分期、转移相关，但其在骨肉瘤细胞中的作用尚不明确[6]。本实验通过干扰URG11的表达，探讨URG11对骨肉瘤细胞恶性表型的影响，为靶向URG11治疗骨肉瘤提供依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 细胞和试剂

　　骨肉瘤细胞MG63购自上海研谨生物科技有限公司;polybrene购自美国Sigma公司;SYBR定量PCR试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司;阴性对照慢病毒和URG11短发夹RNA(shRNA)重组慢病毒由吉满生物科技(上海)有限公司构建;基质金属蛋白酶2(MMP-2)抗体、URG11抗体购自美国Abcam;裂解的半胱氨酸蛋白酶-3(Cleaved Caspase-3)抗体、基质金属蛋白酶9(MMP-9)抗体、E-钙黏蛋白(E-cadherin)抗体、

　　裂解的半胱氨酸蛋白酶-9(Cleaved Caspase-9)抗体、波形蛋白(Vimentin)抗体购自美国Santa Cruz Biotechnology。

　　1.2 慢病毒感染

　　骨肉瘤细胞以每孔5×104个接种6孔板，于培养箱内培养，细胞融合度为40%时，以MOI=20分别添加慢病毒，再加入适量的polybrene(终浓度为5 mg/L);培养12 h以后，加入新鲜培养液;培养72 h后荧光显微镜下观察荧光表达情况，以1 mg/L的嘌呤霉素筛选稳定转染的细胞系。把不感染慢病毒的细胞设置为Control组(A组)，把感染阴性对照慢病毒以及URG11 shRNA重组慢病毒的细胞分别设置为shRNA-NC(B组)、URG11 shRNA(C组)。

　　1.3 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)测定干扰效果

　　A、B、C组细胞提取总RNA，反转录成cDNA后进行qRT-PCR。所用引物种类及其序列见表1。用SYBR定量PCR试剂盒分析URG11表达变化，计算方法为2-△△CT法，内参为β-actin。每组实验重复3次，每次设3个复孔。

　　1.4 蛋白免疫印迹(Western blot)测定干扰效果

　　A、B、C组细胞分别用PBS洗涤2次，再加入含有PMSF的RIPA裂解溶液，于冰上孵育30 min。以BCA法测定蛋白样品浓度，每孔30 μg蛋白样品，设置120 V的电压电泳2 h后，从玻璃板中間取出凝胶。将PVDF膜置于甲醇中孵育10 s以后进行转膜，转膜置于4 ℃条件进行。将PVDF膜置于新配置的含体积分数0.05牛血清蛋白溶液中，在室温结合2 h。把URG11一抗按1∶800倍稀释，PVDF膜置于一抗反应液中孵育过夜。再将二抗按1∶2 000倍稀释后，把PVDF膜置于二抗反应液内孵育2 h。使用ECL发光。采用Image J分析内参β-actin和目的条带URG11的灰度值，URG11蛋白水平=URG11的灰度值/β-actin的灰度值。每组实验重复3次，每次设3个复孔。

　　1.5 四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测细胞增殖

　　A、B、C组细胞培养24 h，添加20 μL的MTT溶液和180 μL细胞培养液至每个孔内培养4 h，再加入150 μL的二甲基亚砜，混合反应后，经空白孔调零。以酶标仪检测570 nm波长处的吸光度(A)值，把Control细胞的存活率设置为100%，分析其他各组细胞存活率变化。每组实验重复3次，每次设3个复孔。

　　1.6 流式细胞术检测细胞凋亡

　　A、B、C组细胞中分别添加500 μL的Binding Buffer，混合后再添加PI和Annexin V-FITC染液孵育15 min，置于流式细胞仪中检测细胞凋亡变化。每组实验重复3次，每次设3个复孔。

　　1.7 Transwell小室检测细胞侵袭和迁移

　　A、B、C组细胞以不含血清的培养液悬浮，细胞密度调整为7×107/L，分别添加到Transwell小室的上室内进行迁移实验。每组添加200 μL细胞悬液，下室内添加500 μL的含血清培养液。24 h后，将小室取出，把没有穿膜的细胞擦掉并以PBS洗涤后，分别添加多聚甲醛溶液固定30 min，添加甲紫染色后，在光镜下选取5个视野，计数细胞迁移数目。在侵袭实验前以基质胶将Transwell小室湿化，其余步骤同迁移实验。每组实验重复3次，每次设3个复孔。

　　1.8 Western blot检测细胞中相关蛋白表达变化

　　A、B、C组细胞按照1.4中Western blot方法检测Cleaved Caspase-3、MMP-9、Cleaved Caspase-9、E-cadherin、MMP-2和Vimentin蛋白表达变化。每组实验重复3次，每次设3个复孔。

　　1.9 统计分析

　　采用SPSS 21.0软件分析实验数据，计量资料数据用±s表示，多组差异比较用单因素方差分析，组间比较用SNK-q检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 URG11 shRNA下调对骨肉瘤细胞中URG11表达水平影响