miRNA-375通过MYC/EMT对NSCLC细胞侵袭和迁移影响
[摘要] 目的 探究miRNA-375(miR-375)通過MYC/上皮间质转化(EMT)对非小细胞肺癌(NSCLC)侵袭和迁移的影响。
方法 将未做任何处理的NSCLC细胞A549作为空白组，转染空载慢病毒的A549细胞作为对照组，转染表达miR-375慢病毒的A549细胞作为实验组。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测miR-375在NSCLC组织和癌旁组织中的表达量，以及miR-375在正常肺组织细胞(BEAS-2B细胞)和A549细胞中的表达量;通过Transwell实验检测3组细胞的侵袭、迁移能力;采用Western blot检测3组细胞中MYC蛋白和EMT相关蛋白(E-钙黏蛋白、波形蛋白)的表达量。
结果 miR-375在NSCLC组织中的表达量显著高于癌旁组织(t=16.88，P<0.05)，在A549细胞中的表达量显著高于BEAS-2B细胞(t=8.51，P<0.05)。过表达miR-375后，实验组与空白组和对照组相比，NSCLC细胞的侵袭(F=29.55，P<0.05)、迁移(F=90.21，P<0.05)能力增强，MYC蛋白表达增加(F=37.15，P<0.05)，E-钙黏蛋白表达减少(F=47.25，P<0.05)，波形蛋白表达增加(F=77.64，P<0.05)。
结论 上调miR-375可以通过MYC/EMT影响NSCLC的侵袭和迁移能力。
[关键词] 微RNAs;癌，非小细胞肺;基因，myc;上皮-间质转化;细胞运动
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肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，同时也是全球恶性肿瘤死亡的主要原因[1-2]，其中非小细胞肺癌(NSCLC)占所有肺癌的80%以上[3]。NSCLC目前的主要治疗方法是手术、放疗和化疗，尽管放疗和化疗的应用使NSCLC预后得到很大改善，但其生存率还是很低[4]，所以NSCLC的靶向研究显得尤为重要。近年来研究结果发现，miRNA对肺癌的进展、诊断以及治疗起着关键作用，其在肺癌的治疗研究中备受关注[5]。miRNA是一类长约20个氨基酸的小RNA，它可以与特定的靶点结合，影响靶位点的mRNA翻译，进而影响相关蛋白的表达[6]。有研究表明，miRNA-375(miR-375)与肿瘤的侵袭、转移和凋亡有着密切的联系，而且miR-375的表达与癌症病人的总生存率相关，所以推测miR-375可能是一种有用的临床预后生物标志物[7-8]。JUNG等[9]研究发现，MYC可以受miR-375的调节进而影响肿瘤的进展和表型。MYC家族包括C-MYC、N-MYC和L-MYC，对肿瘤细胞的侵袭、迁移都有很重要的作用[10-11]。已有研究表明，一些药物可以通过抑制MYC通路的激活来抑制人宫颈癌细胞的增殖、迁移和上皮间质转化(EMT)[12];hsa-miR-24则可以通过调节c-MYC/EMT轴来抑制鼻咽癌细胞的转移能力[13];MYC还可以通过抑制RPS19/EMT信号传导的激活来抑制癌细胞的转移[14]。本研究旨在探讨miR-375是否可通过MYC/EMT对NSCLC的侵袭和迁移产生影响。
1 材料与方法
1.1 细胞与样本
所用NSCLC细胞(A549)和正常肺组织细胞(BEAS-2B)由青岛大学博雅楼实验室冻存。A549细胞用RPMI-1640(HyClone，美国)培养液培养，BEAS-2B细胞用LHC-9(HyClone，美国)培养液培养，培养细胞时两种培养液都加入体积分数0.10胎牛血清(索莱宝，北京)。含EDTA的胰蛋白酶(索莱宝，北京)用于消化贴壁细胞。NSCLC组织和癌旁组织的新鲜样本各30例，来自青岛市市立医院。本研究的组织来源病人均签署了书面同意书，研究获青岛大学附属医院伦理委员会批准。
1.2 细胞转染
将A549细胞接种于96孔板中，每孔10 000个，置于含体积分数0.05 CO2的37 ℃培养箱中培养24 h。实验共分3组，在96孔板中未做任何处理的A549细胞作为空白组，将转染含空载体慢病毒(吉凯基因公司，上海)的A549细胞作为对照组，将转染表达miR-375慢病毒(吉凯基因公司，上海)的A549细胞作为实验组。将3组细胞置于培养箱继续培养10 h后，移除96孔板中的培养液，更换新的培养液，每孔100 μL。然后继续培养72 h，应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测3组细胞中miR-375的表达量。
1.3 qRT-PCR
收集长势良好的细胞，按照iso plus RNA提取试剂盒(Takara，日本)的说明书提取3组细胞的总RNA，用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)(Takara，日本)将RNA反转成cDNA，使用SYBR Premix Ex Taq RR420A(Takara，日本)进行qRT-PCR，检测细胞中miR-375的表达。反应条件：95 ℃、30 s;95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，40个循环;60 ℃、15 s。实验所用引物均购自上海生工，其中U6作为miRNA-375的内源性参照。引物序列见表1。
1.4 Transwell小室实验
①迁移实验：向24孔板(康宁，美国)的3个孔中加入含体积分数0.15胎牛血清的培养液，每孔500 μL，将3个Transwell小室(康宁，美国)分别放入3个孔中。取3组细胞各5×104个分别接种于以上3个Transwell小室内，置于细胞培养箱中培养24 h后取出，用棉签擦拭3个Transwell小室的内膜，之后小室用甲醇溶液固定10 min，用甲紫染色10 min，PBS洗3次，拍照，在显微镜下计数细胞。②侵袭实验：将基质胶(康宁，美国)与完全培养液按1∶9的比例稀释，将稀释后的混合液按每孔100 μL加入Transwell小室中，置于37 ℃培养箱中4 h，其余实验步骤同迁移实验。
1.5 Western blot檢测
取3组细胞，用PBS洗2次后加入1 mL的PBS，使用细胞刮刀将细胞刮下分别放入3个离心管中，以5 000 r/min离心5 min。去上清留细胞沉淀，在细胞沉淀中加入细胞裂解液和蛋白酶抑制剂，冰上裂解30 min，以12 000 r/min离心10 min，上清即为总蛋白。将提取的蛋白质加入上样缓冲液SDS-Loading Buffer，沸水浴煮5 min。取45 μg蛋白置SDS-PAGE凝胶中电泳，电泳结束后将胶中的蛋白条带转移到PVDF膜上(Millipore，美国)。用脱脂奶粉封闭2 h，在4 ℃下与MYC(1∶1 000，CST)、β-actin(1∶3 000，Bioss)、E-钙黏蛋白(E-cadherin，1∶1 000，CST)、波形蛋白(Vimentin，1∶1 000，CST)的一抗一起孵育过夜;加入二抗(1∶1 000，Abcam)低速振荡60 min。用超敏型化学发光底物试剂(ECL)进行蛋白条带成像，分析条带灰度值，计算各蛋白相对表达量。