2000年4月，陕西省岐山县种猪繁育场仔猪流行关节炎和败血症。无菌采取患关节炎猪的关节液和患败血症猪的肝、肺、脾及肠系膜淋巴结各8份病料，并对这16份病料进行病原菌分离试验、血清学鉴定、致病力试验、保护力试验、细菌回收试验、药敏试验。结果表明：该病原菌为2型猪链球菌，引起关节炎的猪链球菌较引起败血症的猪链球菌致病力弱;该菌对头孢菌素、青霉素高度敏感。
关键词：猪链球菌 分离与鉴定
猪链球菌的分离与鉴定
摘 要
2000年4月，陕西省岐山县种猪繁育场仔猪流行关节炎和败血症。无菌采取患关节炎猪的关节液和患败血症猪的肝、肺、脾及肠系膜淋巴结各8份病料，并对这16份病料进行病原菌分离试验、血清学鉴定、致病力试验、保护力试验、细菌回收试验、药敏试验。结果表明：该病原菌为2型猪链球菌，引起关节炎的猪链球菌较引起败血症的猪链球菌致病力弱;该菌对头孢菌素、青霉素高度敏感。
关键词：猪链球菌 分离鉴定
前 言
猪链球菌(Streptococcosis suis)是猪的一种重要疾病，养猪业发达国家如美、英、荷及爱尔兰等常有本病发生。我国于1958年就有猪链球菌病的报道，1976年我国南方几省曾一度广泛流行，给我国养猪业带来了很大危害。
猪链球菌截止到目前已发现的荚膜型已超过30种[1]。我国于1995年首例鉴定证实2型猪链球菌在我国的存在 [2]。猪链球菌可致2—6周龄仔猪败血症、脑膜炎、关节炎及支气管肺炎等[3-7]。病猪和带菌猪是本病的重要传染源，病猪的鼻液、尿液、血液、肌肉、内脏和关节内均可检出病原体。未经无害处理的病死猪肉、内脏及废弃物是散播本病的重要原因，呼吸道是本病的主要传播途径。本病一年四季均可发生，但以4—10月份发生较多。本病常为地方性流行性，多呈败血性。短期波及全群，如不进行防治，则发病率、病死率很高，慢性常为地方性散发性传染。
2000年4月，岐山县种猪繁育场仔猪流行关节炎及败血症，多为2—6周龄仔猪。无菌采取关节炎病猪的关节液及败血症病猪的肝、脾、肺及肠系膜淋巴结，经实验室分离鉴定，证实为2型猪链球菌。现将分离鉴定结果报告如下。
1. 实验材料
1. 1病料 无菌采取岐山县种猪繁育场患关节炎病猪的关节液8份，编号为1—8号，无菌采取患败血症猪的肝、肺、脾及肠系膜淋巴结8份，编号为9—16号。
1. 2试剂 试验所用的各种糖均购自上海化学试剂二厂，批号自95—98年不等。
1. 3培养基 绵羊鲜血平板、匹克氏增菌液、10ml/L猪血清肉汤及各种糖培养基按常规方法制备[8]。
1. 4血清学试验 猪链球菌诊断血清与平板凝集抗原均购自中国兽药鉴察所，批号为990705。
1. 5药敏纸片 购自浙江省军区后勤部，批号20000312。
1. 6试验动物 健康小白鼠(30—35g)50只，购自第四军医大学实验动物中心。
2. 方法
2. 1 病原分离
将所采病料分别涂片，革兰氏染色镜检，然后，分别接种鲜血琼脂平板。37℃需氧培养24h后，挑取可疑菌落接种于匹克氏增菌液，37℃培养24h后，革兰氏染色，显微镜检查，再接种血清肉汤，纯化后放置4℃，冷藏备用。
2.2 分离菌株的鉴定
2.2.1生化试验
随机抽取上述分离菌血清肉汤培养物3#、8#、13#、15#，分别接种于蔗糖、山梨醇、棉实糖、葡萄糖、甘露糖、蕈糖、乳糖、菊糖、水杨苷、马尿酸钠培养基，37℃培养24h后，观察其对糖的利用情况。
2.2.2血清学鉴定
将3#、8#、13#、15#菌经缓冲肉汤培养8h，通过3000r/min离心10min，PBS洗涤2次，用Ph7.2 的0.01mol/L PBS制成 1*10 10~2*10 10细菌悬液。取1滴上述细菌悬液与适当的抗血清在洁净玻片上混匀，立即观察凝集现象。同时，设立细菌悬液对照及血清对照。
2.3 致病力及保护力试验
2.3.1菌落形成单位的测定 按常规方法进行[9]
2.3.2致病力试验
无菌吸取上述血清肉汤培养物 (含菌量5.0*10 8CFU/ml)以0.1ml /只、0.2ml/只、 0.3ml/只、 0.4ml /只、0.5ml/只分别腹腔注射小白鼠2只，观察其死亡时间和数量，测定其最小致死量。再将上述血清肉汤培养物腹腔注射小白鼠，小白鼠共14只，分7 组。第一组，每只小白鼠注射3#菌0.2ml，第二组每只注射8#菌0.2ml，第三组每只注射3#、8#菌各0.1ml，第四组每只注射13#菌0.2ml，第五组每只注射15#菌0.2ml，第六组每只注射13#、15#菌各0.1ml，第七组每只注射无菌血清肉汤1.0ml。以上各组分别饲养观察其死亡时间及数量。
2.3.3保护力试验
将3#、8#、13#、15#血清肉汤培养物分别接种于18 cm鲜血平板。37℃培养24h后，收菌，用麦氏比浊管比浊，适当稀释，然后用0.3%甲醛灭活;37℃作用24h;作无菌检验。然后分别腹部皮下接种小白鼠2只，0.4ml/ 只。10天后，再分别人工感染，0.2ml/只。
2.3.4细菌回收试验
对致病力试验出现症状及死亡小白鼠剖检，并采集病料，进行分离。
2.4药敏试验
采用纸片扩散法，用无菌棉签蘸取分离菌的血清肉汤培养物，均匀涂布于9cm鲜血平板;待稍干后，用无菌镊子将各种药敏纸片分别平贴在培养基表面，4℃2h使药物扩散，然后置37℃培养20—24h，观察结果。结果按抑菌圈直径大小和各抗菌药的具体标准，评定为高度敏感、中度敏感或耐药。结果评定参照表1。
表 1 各种抗菌药物的抑菌圈与敏感标准
抗菌药物名称
抑菌圈直径(mm)
耐药
中度敏感
高度敏感
青霉素
土霉素
洁霉素
链霉素
庆大霉素
卡那霉素
头孢菌素
13
>15
>15
>15
>15
>15
>15
3.结果
3.1分离细菌的培养特性及形态特征
3.1.1培养特性
37℃培养24h后，所采的12份病料在鲜血琼脂平板上形成表面光滑、隆起的灰绿色小菌落，外层有明显的β溶血环。该菌在匹克氏增菌液中底部有沉淀，在血清肉汤中先均匀浑浊，后在试管底部形成沉淀，上部澄清，不形成菌膜。
3.1.2染色特性
关节液、鲜血琼脂、匹克氏增菌液及血清肉汤培养物涂片、革兰氏染色、显微镜检查为革兰氏阳性，在关节液、鲜血琼脂培养物中多呈单个、双球或短链状排列，在匹克氏增菌液及血清肉汤培养物中多呈长链状。
3.2生化试验结果(见表2)
表2 分离菌生化试验结果
鉴定 蔗糖 山梨 棉实 葡萄 甘露 蕈糖 乳糖 菊糖 水杨 马尿
项目 醇 糖 糖 糖 苷 酸钠
3# + - - + + + + + + -
8# + - - + + + + + + -
13# + - - + + + + + + -
15# + - - + + + + + + -
判定标准：“+”表示大多数(90%—100%)菌株为阳性;“-”表示大多数(90%—100%)菌株为阴性。
表2表明分离的3#、8#、13#、15#菌的生化反应结果均符合猪链球菌的生化特性，说明分离的菌均为猪链球菌。
3.3 血清学鉴定结果
将3#、8#、13#、15#细菌悬液与1/2及2型抗血清混合，立即可见明显的凝集现象，但不与1型及其他型抗血清出现凝集。直接挑取细菌菌落与血清混匀，也能得到一致结果。阴性对照均未见凝集现象。
3.4 致病力试验结果及保护力试验结果
3.4.1致病力试验结果
第一组、第二组小白鼠注射血清肉汤培养物48h内均未见死亡，第三组48h内有一只死亡，第四组、第五组、第六组在注射血清肉汤培养物18h内全部死亡。死亡后，小白鼠皮肤发绀，剖检肝、脾、肺、心出血，呈败血症。第七组健活。由于第一、二、三组死亡数量非常少，所以，再用相同剂量分别背部皮下接种小白鼠各2只，48h后处死，剖检发现注射部位有直径0.9~1.1cm的脓肿，浓汁呈黄绿色。
3.4.2保护力试验结果 免疫的小白鼠再经攻毒后均未发病。
3.5细菌回收试验结果
将上述死亡及发病的小白鼠剖检采集病料，进行细菌分离、生化试验及血清学鉴定，能得到原分离菌。
3.6药敏试验结果(见表3)
表3 药敏试验结果
菌号
抑菌环直径(mm)
头孢菌素 青霉素 洁霉素 卡那霉素 土霉素 链霉素 庆大霉素
3# 19 15 14 13 8 7 7
8# 18 16 13 13 8 6 7
13# 19 16 14 13 7 7 8
15# 19 15 13 14 8 8 8
平均值 18.75 15.5 13.5 13.25 7.75 7.0 7.5
表3表明，结果敏感的药物依次是：头孢菌素、青霉素;中度敏感的依次是：洁霉素和卡那霉素;而对土霉素、链霉素、庆大霉素具有抗药性。
4.分析与讨论
4.1 猪链球菌(Streptoccus suts)是危害养猪业的一种重要病原菌。80年代初，加拿大由猪链球菌引起的疾病开始增加。那时仅检出9种夹膜血清型，其中2型是最常见的。
4.2 猪链球菌病在临床上有败血型、脑膜脑炎型、关节炎型支气管炎型等。过去屡有败血型猪链球菌的报道，而关于集约化养猪场关节炎型链球菌病的报道较少。本次试验从患关节炎猪的关节液中成功的分离出了猪链球菌。另外，岐山种猪场，约有60%的仔猪流行关节炎，严重者可发生败血症而死亡，给种猪场造成巨大的经济损失。所以，研究本病可为生产中防制本病提供理论依据。
4.3 病猪和带菌猪是本病的重要传染源。病猪的鼻液、尿液、肌肉、内脏和关节内均带有病原体，所以，我们建议，首先应加强对健康猪的免疫。另一方面，在发病后，加强病猪和健康猪的隔离，根据实验室所做的药敏试验结果，配合药物治疗，建议用头孢菌素、青霉素、洁霉素等药物治疗。岐山县种猪繁育场采纳我们的建议后，首先对所有的未发病仔猪用灭活疫苗免疫接种，对已发病的猪用青霉素等药物配合治疗。另外，注意卫生管理。目前该病已得到有效的控制。
4.4 从致病力试验结果可以看出，引起猪关节炎的猪链球菌的致病力较小，而引起败血症的猪链球菌的致病力较强。但通过生化试验和血清学鉴定，它们又是同种细菌且血清型也相同。为什么同种血清型的猪链球菌的致病力差别很大?这个问题还有待于进一步研究。
参考文献
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