响应面结合遗传算法优化鹰嘴豆中抗炎活性成分的提取

　　摘要：以异黄酮提取率为评价指标，考察超声时间、乙醇浓度和料液比对鹰嘴豆异黄酮提取率的影响，在单因素实验基础上，利用响应面结合遗传算法优化鹰嘴豆异黄酮提取工艺，得到最佳提取工艺条件为：提取时间为 1.73 h、乙醇浓度为 78.64%和料液比 1:24.9 g/mL，鹰嘴豆中异黄酮提取率为 0.76 mg/g。以 5-脂氧合酶为作用靶点，利用超滤-质谱技术(UF-MS)筛选鹰嘴豆中具有抑制 5-脂氧合酶作用的潜在抗炎活性成分。结果表明，利用响应面结合遗传算法可以进一步优化提高鹰嘴豆中活性成分的提取率;鹰嘴豆中具有潜在的抗炎活性成分为大豆苷、大豆苷元、毛蕊异黄酮、后莫紫檀素和鹰嘴豆芽素 A，其结合强度分别为 40.82%、36.93%、31.65%、28.75%和 22.51%。

　　关键词：鹰嘴豆(Cicer arietinum L.);响应面(RSM);遗传算法(GA);超滤-质谱(UF-MS); 5-脂氧合酶(5-LOX)

　　牛华周; 康贺磊; 侯万超; 刘春明; 李赛男; 张语迟; 刘震 中国粮油学报 2021-12-31

　　鹰嘴豆(Cicer arietinum L.)又名鸡豆和桃豆等，是豆科鹰嘴豆属植物鹰嘴豆的种子，在我国多个省份均有种植[1]，具有补中益气、温肾壮阳、主消渴之功效[2]。近年来，国内外对鹰嘴豆的生物活性研究多有报道，鹰嘴豆中所含的异黄酮类成分具有抗氧化和抑制 Caco-2 细胞生长等作用[3]，但是对于鹰嘴豆中抗炎活性的研究报道很少。而 5-脂氧合酶对于炎症的发生存在着密不可分的关系[4]，因此利用 5-脂氧合酶对鹰嘴豆中抗炎活性成分进行初步研究，为从鹰嘴豆中分离抗炎活性成分提供一定的参考。鹰嘴豆异黄酮提取工艺参数的优化是非线性的拟合过程，因此利用遗传算法较为合适。遗传算法是一种模拟自然进化过程的全局寻优算法[5]，在优化天然产物有效成分的提取条件中有着广泛应用[6]。本实验利用响应面对鹰嘴豆异黄酮提取过程中的超声时间、乙醇浓度和料液比 3 个因素进行模拟推算，将响应面优化所得的拟合函数作为遗传算法的适应性函数，在程序中进行个体评价、选择运算、交叉运算以及变异运算。运行遗传算法优化利用 Matlab 2018b 程序和程序附带的 GAOT 工具箱完成[7]。实验以鹰嘴豆为研究对象，首先从单因素水平考察了提取条件对提取率的影响;其次，应用响应面结合遗传算法优化鹰嘴豆异黄酮的提取方法;利用超滤-质谱技术对鹰嘴豆粗提中的化学成分进行抗炎活性成分筛选。应用液-质联用技术对鹰嘴豆中抗炎活性成分进行初步鉴定。

　　1 材料与仪器

　　1.1 材料与仪器

　　鹰嘴豆，豆科鹰嘴豆属植物鹰嘴豆的种子。5-脂氧合酶;乙腈(色谱级);超滤离心管(100 ku)。 Waters 2695 高效液相色谱仪，LCQ-Fleet 超高效液相色谱-高分辨质谱联用仪，DK-98-Ⅱ 恒温水浴锅，KQ-400DE 型超声波清洗器。

　　1.2 方法 1.2.1 超声辅助提取工艺的优化 1.2.1.1 芦丁标准品标准曲线的绘制

　　取 5.12 mg 芦丁标准品用 65%乙醇溶液溶解、定容于 25.0 mL 容量瓶中备用。分别取 1.0、 2.0、3.0、4.0、5.0 和 6.0 mL 芦丁标准品溶液，按照文献[8]方法分别加入显色剂，显色 10 min，采用紫外-可见分光光度计在 510 nm 测定不同浓度芦丁标准溶液的吸光度，制作鹰嘴豆异黄酮浓度吸光度标准曲线。

　　1.2.1.2 鹰嘴豆的提取

　　鹰嘴豆粉碎后过 100 目筛，按料液比加入乙醇溶液，超声提取，过滤后蒸干，用 65% 乙醇溶解，显色，测定鹰嘴豆异黄酮含量。

　　1.2.1.3 单因素实验

　　准确称取粉碎后的鹰嘴豆 5.0 g，采用超声法提取鹰嘴豆异黄酮，分别考察了超声时间(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h)、乙醇浓度(35.0%、45.0%、55.0%、65.0%、75.0%、 85.0%、95.0%)和料液比(1：10.0、1：15.0、1：20.0、1：25.0、1：30.0、1：35.0、1： 40.0 g/mL)对鹰嘴豆异黄酮提取率的影响。

　　1.2.1.4 响应面实验

　　依据单因素实验结果，选取超声时间(X1)、乙醇浓度(X2)和料液比(X3)为实验因素，以异黄酮得率(Y)为响应值，利用 Design-Expert 中的 Box-Behnken 组合，进行 3 因素 3 水平的响应面实验，实验因素与水平设计如表 1 所示。 式中：Xi 和 Xj为自变量，b0、bi、bii 和 bij分别为截距、线性回归、二次项的回归、各交互项的回归的系数[9]。

　　1.2.1.5 遗传算法设计优化

　　在 MATLAB 程序中，利用神经网络工具箱对数据进行神经网络建模。实验创建的提取因素优化模型为 3 层 ANN 模型(输入层、隐含层和输出层)，输入层作为自变量;输出层给出因变量[10]。选择超声时间、乙醇浓度和料液比为自变量，鹰嘴豆异黄酮提取率为因变量，选择输入层三个神经元，输出层一个神经元的网络模型。经过多次训练实验，得到了最佳的神经网络模型。采用优化得到的拟合函数，利用遗传算法对输入变量(超声时间、乙醇浓度和料液比)进行优化，以使鹰嘴豆异黄酮提取率最大为目标。设置遗传算法的搜索范围大小为-1～1，优化得出全局优化解[11]。

　　1.2.2 超滤-质谱法筛选鹰嘴豆提取物中 5-脂氧合酶抑制剂

　　200.0 μL 的反应体系分别由 100.0 μL Tris-HCl 缓冲溶液、20.0 μL 300 mg/mL 样品溶液与 80.0 μL 不同浓度的 5-脂氧合酶溶液(0、0.5、1.0 和 10 U/mL，pH 7.2~7.4)组成，将反应体系涡旋震荡，混匀后 37℃水浴孵育 30 min，利用超滤膜(100 ku)分离与酶结合的复合物和未结合的小分子，分离时采用离心机在 13000 r/min 的条件下离心 10 min。加入 100.0 μL Tris-HCl 缓冲溶液冲洗超滤膜，冲洗未结合的小分子化合物，离心 10 min，重复该操作 3 次。再加入 100.0 μL 50%甲醇水(50：50)溶液，释放与 5-脂氧合酶结合的活性小分子，离心 10 min，重复步骤 3 次。将甲醇洗脱液合并，分析测定各活性成分的含量。空白对照组由缓冲溶液代替酶溶液，其他条件不变，重复实验 3 次。活性成分与酶的结合能力以增强因子表示，计算公式为：

　　式中：A1 为与 5-脂氧合酶结合的活性小分子化合物的量，A2 为未与 5-脂氧合酶结合的小分子化合物初始的量[12]。

　　1.2.3 高效液相色谱以及质谱检测条件

　　色谱柱为 SunFireTM C18 色谱柱(4.6 mm × 250 mm，I.D.5.0 μm，Waters)，检测器：Waters 2998 二极管阵列检测器，流动相：水(A)和乙腈(B)，洗脱梯度：0~10 min，3%~3% B; 10~40 min，3%~65% B;40~60 min，65%~100% B，检测波长：254 nm，进样量：10.0 μL。利用六通阀联接质谱与液相色谱二极管阵列检测器(DAD)，选择大气压化学电离离子源(APCI)为质谱离子源，扫描范围为 150~400 0;采用正离子分析模式;离子阱压力为 3.10 × 107 Pa;鞘气辅助气为高纯度 N2。液相色谱参数同上述高效液相色谱参数。

　　1.2.4 数据统计与分析

　　每组实验重复 3 次，结果用“平均值±标准差”表示;采用 Design-Expert 软件中 Box- Behnken 组合对实验数据进行方差分析(ANOVA);采用 Matlab 软件优化超声提取鹰嘴豆中异黄酮工艺参数;Design-Expert8.0.6 软件设计组合实验以及绘制响应面图形，利用 Origin 进行单因素试验绘图。

　　2 结果分析

　　2.1 单因素试验结果

　　超声提取鹰嘴豆异黄酮的单因素实验，结果如图 2 所示。超声时间在 0~1.5 h 内鹰嘴豆异黄酮提取率逐渐增加，超时时间大于 1.5 h 后提取率逐渐降低。提取时间为 1.5 h 时，鹰嘴豆异黄酮提取率达到最大值。由于超声破坏了鹰嘴豆的细胞壁和细胞膜，导致鹰嘴豆细胞内异黄酮大量溶出，因此超声时间越长，异黄酮的溶出率越高，随提取时间的继续增加，鹰嘴豆细胞组织中大量细胞破裂，其他杂质的溶出，影响鹰嘴豆异黄酮的溶出率[13]，因此最佳超声时间为1.5h。

　　鹰嘴豆异黄酮的提取率在乙醇浓度为 30%~70%时，随着乙醇浓度的增加逐渐升高，当乙醇浓度大于 80%时，提取率逐渐降低。该现象可能由于乙醇浓度增加，异黄酮的溶解度逐渐降低引起的。异黄酮一般易溶于高浓度有机溶剂，但异黄酮苷一般易溶于低浓度乙醇等有机溶剂。异黄酮苷在超声提取条件下不易分解，因此在乙醇浓度为 35%~75%时，提取率逐渐增加，当乙醇浓度继续增加时，将不利于鹰嘴豆中大量的异黄酮苷的溶出，因此提取率会降低[14]，因此最佳乙醇浓度的为 75%。

　　鹰嘴豆异黄酮提取率在料液比 1：10.0 至 1：25.0g/mL 之间呈现逐渐增加的趋势，是因为随着料液比的增加，鹰嘴豆和溶剂之间的浓度差增加，加速异黄酮的溶出。当料液比大于 1：25.0 时，乙醇体积过多时也可能造成其他物质的渗出，影响异黄酮的溶出[15]。因此最佳料液比为 1：25.0 g/mL。

　　2.2 响应面分析实验结果

　　鹰嘴豆异黄酮的提取条件选取超声时间、乙醇浓度和料液比三个因素，根据 Box-Behnken 实验原理，利用 Design-Expert 程序，设计三因素三水平的响应面实验，见图 3。利用响应面优化鹰嘴豆异黄酮的最佳提取条件，并拟合出相应的函数，结合神经网络进行进一步优化。利用响应面拟合得到的函数为： 2 2 2 Y A B C AB BC A B C          0.74 0.04 0.05 0.02 0.04 0.03 0.06 0.10 0.14 (3)所选用的二次多项模型 P < 0.05，R 2=0.92，说明该模型二次方程显著，本方法可靠，对模拟分析三因素三水平实验条件是可行的。并且 f>0.05 为模型项显著。

　　2.3 遗传算法优化实验结果

　　利用 Matlab R2018b 软件中的遗传算法优化工具箱，在响应面所构建的拟合函数的基础上，以鹰嘴豆异黄酮提取率为遗传算法的适应度函数。经过 N 迭代后，适应度函数值趋向适应度最高的个体[16]，即鹰嘴豆异黄酮提取率的最大值。由图 4 可见，当迭代 13 次时，群体的适应性函数变化趋势达到最大值 0.76，即鹰嘴豆异黄酮提取率最大值为 0.76 mg/g，此时超声时间(X1)、乙醇浓度(X2)、和料液比(X3)水平编码分别为 0.47、0.36 和-0.02，即实验水平分别为 1.73 h、78.64%和 1:24.9 g/mL。在此条件下，提取鹰嘴豆中异黄酮的成分，所得异黄酮含量理论值为 0.76 mg/g，遗传算法优化结果如图 4 所示。响应面与遗传算法相结合对鹰嘴豆最佳提取工艺进行优化，能较准确地优化鹰嘴豆异黄酮的最佳提取条件。

　　2.4 超滤-质谱技术筛选鹰嘴豆 5-脂氧合酶抑制剂

　　鹰嘴豆超滤实验的空白对照组以及分别与 80.0 μL 不同浓度的 5-脂氧合酶(0.5、1.0 和 10.0 U/mL)结合的实验组 HPLC 图见图 5。鹰嘴豆提取物中有 5 个成分可以与 0.5、1.0 和 10.0 U/mL 的 5-脂氧合酶结合，对 5-脂氧合酶存在一定的抑制作用，具有潜在的抗炎活性[17]。各活性成分与酶的结合强度用结合因子为，考察 5 个化合物与 5-脂氧合酶的结合能力。由表 2 可知：5 个活性成分对浓度为 1.0 U/mL 的 5-脂氧合酶活性抑制效果显著，其中化合物 5 的结合强度最高，其次为化合物 2、化合物 3、化合物 4 和化合物 1。通过超滤-质谱技术研究鹰嘴豆与 5-脂氧合酶的抑制作用，操作简便，超滤-质谱技术具有高通量检测的优势，是一种快速高效的初步筛选复杂提取物中活性成分的手段，具有低成本、操作简单等优势。

　　2.5 液-质联用技术初步鉴定鹰嘴豆中化学成分

　　利用液-质联用技术对鹰嘴豆提取物中的化学成分进行初步的分离与鉴定，通过质谱信息与标准品比对，分析鹰嘴豆中的化学成分的信息，结果如表 3。利用液-质联用技术对鹰嘴豆提取物中活性成分进行初步鉴定和解析，根据各化合物的保留时间、分子离子以及碎片离子等信息，鉴定 5 个具有抑制 5-脂氧合酶活性的异黄酮类化合物分别为大豆苷、大豆苷元、毛蕊异黄酮、后莫紫檀素和鹰嘴豆芽素 A [19-22]。

　　3 结论

　　利用遗传算法结合响应面优化鹰嘴豆中异黄酮的提取工艺，优化得到最佳提取工艺为：提取时间为 1.73 h、乙醇浓度为 78.64%和料液比 1:24.90 g/mL，在此条件下，鹰嘴豆中异黄酮提取率为 0.76 mg/g。利用超滤质谱法筛选出鹰嘴豆中 5 个具有抑制 5-脂氧合酶的活性成分，5-脂氧合酶活度为 1.0 U/mL 时，抑制酶的活性效果显著，鹰嘴豆芽素 A 与 5-脂氧合酶结合度最高，为天然抗炎药物的开发与利用提供了参考。