绿豆皮中黄酮类化合物的抗氧化活性及其结构分析

　　摘　要：本文旨在分析绿豆皮中黄酮类化合物的抗氧化活性及其结构。采用 20%、40%、60%、80% 乙醇对绿豆皮黄酮粗提物进行梯度洗脱纯化，以总抗氧化能力(total antioxidative capability, T-AOC)、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)自由基清除能力、2，2′-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(2，2′- azinobis-3-ethylbenzothia zoline-6-sulphonic acid，ABTS)自由基清除能力、羟自由基清除能力等为指标，筛选出具有最高抗氧化活性的组分，并对其进行结构鉴定。结果表明，60% 洗脱液中绿豆皮黄酮的抗氧化能力最强，其 DPPH 自由基清除能力为 48.03%;ABTS 自由基清除能力为 57.53%;羟自由基清除能力为 12.02%;T-AOC 的抗氧化活性为 207.64 U/mL，显著高于其他洗脱液(P<0.05)。绿豆皮中具有最强抗氧化活性的黄酮类化合物分别包括牡荆素 (vitexin)、异牡荆素 (isovitexin) 及圣草酚-6-C-β-D-吡喃葡萄糖苷 (eriodictyol-6-C-β-D-glucopyranoside)。

　　关键词：绿豆皮，黄酮类化合物，抗氧化活性，结构分析

　　陈洪生国慧刁静静等-《食品工业科技》2022年

　　绿豆(Vigna radiata)是一种药食同源的食用豆，其富含蛋白质、碳水化合物、矿物质和维生素，还含有丰富的多酚、酚酸和黄酮类化合物等活性成分，这些活性成分由于其较强的抗氧化能力而有利于预防癌症、糖尿病、心血管疾病等非传染性慢性病[1−2]。我国在对绿豆进行工业利用过程中会产生大量绿豆皮，这些绿豆皮多被用作动物饲料或者直接废弃物[3]。绿豆皮中含有大量的黄酮类、多酚类化合物，这些功效成分具有抗肿瘤[4]、降低血脂、降胆固醇等生理功能[5]。因此，绿豆皮可以用来制取黄酮类物质，以提高资源利用率。近年来，国内外有关绿豆皮的研究主要集中在功能成分的制取及营养功效评价，朱文学等[6] 采用超声波辅助水提取绿豆皮黄酮工艺的研究;Yao 等和 Peng 等[4,7] 的研究发现绿豆中富含多酚，这些酚类物质具有较强的 DPPH 自由基清除能力。Lee 等[8] 研究发现绿豆皮提取物黄酮具有抗炎作用。罗磊等[9] 研究表明绿豆皮黄酮对氧化损伤人脐静脉内皮细胞具有保护作用。以上这些研究都证实绿豆皮黄酮具有较好的抗氧化、抗炎等生物活性，但绿豆皮黄酮类物质中起主要作用的活性组分的具体组成，目前还不甚清楚。

　　本试验采用自主研制的连续化制备色谱对绿豆皮黄酮粗提物进行梯度分离，收集不同分级产物分析其抗氧化能力，采用 LC-MS 分析具有最强抗氧化能力级分的结构，以得出绿豆皮黄酮中最强抗氧化活性的组分结构，以期为绿豆皮的高值化利用提供理论支撑。

　　1　材料与方法 1.1　材料与仪器

　　山西明绿豆　大庆萨尔图区博微物资经销处; AB-8 大孔吸附树脂　购于天津南开大学树脂有限公司;芦丁、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-iphenyl2- picrylhydrazyl, DPPH)、2，2′-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(2，2′-azinobis-3-ethylbenzothiazoline -6- sulphonic acid, ABTS)　上海 Macklin 公司;6-羟基2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸(6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid, Trolox) 　 Sigma 公司;乙腈(色谱级)、甲醇(色谱级)、三氯化铁、水杨酸、亚硝酸钠、氧氧化钠、无水乙醇、硝酸铝等试剂　安达市清顺化学试剂公司;总抗氧化能力(total antioxidative capability,T-COA)试剂盒　购于南京建成生物工程研究所。

　　AL-204 电子天平　北京瑞泽康科技有限公司;粉碎机　天津市泰斯特仪器有限公司;连续化制备型不锈钢分离柱　实验室自制;UPLC-Triple-TOF/MS 系统 ：AcquityTM ultra 型高效液相色谱仪　美国 Waters 公司;TU1810 型紫外分光光度计　北京普析通用仪器有限公司;CW-200 型超声-微波协同萃取仪　上海新拓分析仪器科技有限公司。

　　1.2　实验方法 1.2.1 绿豆皮黄酮粗提液的制备

　　采用康维良等[10] 的方法稍作改动，将绿豆皮在 40 ℃ 下恒温干燥，粉碎，过 80 目筛后密封保存。配制料液比为 1:31(g/mL)绿豆皮粉末样品溶液，采用超声-微波协同萃取仪进行绿豆皮黄酮的提取，微波功率为 521 W，时间 30 min，结束后将提取物进行 3500 r/min 离心 10 min，收集上清液，低温保存备用，得到绿豆皮黄酮粗提液(测得绿豆皮提取物中黄酮含量为 2.26%)。

　　1.2.2 绿豆皮黄酮的分离纯化　采用本实验室自制的连续化制备型不锈钢分离装置，根据课题组前期分离纯化条件对绿豆皮黄酮粗提物进行分离纯化。以 1 mL/min 流速将绿豆皮黄酮粗提物泵入分离柱中进行饱和吸附，然后分别采用 1~1.5 倍体积的 20%、 40%、60%、80% 乙醇进行梯度洗脱，收集不同洗脱级分的洗脱液备用。

　　1.2.3 绿豆皮黄酮抗氧化能力的测定

　　1.2.3.1 DPPH 自由基清除能力的测定　参照陈青青等[11] 方法稍作改动，分别取样品 0.1 mL 样品(浓度 2%)，加入 3.9 mL DPPH(30 μmol/L)溶液，避光 30 min，517 nm 测吸光度，按式(1)计算 DPPH 自由基清除率。 DPPH自由基清除率(%) = ( 1− A1 −A3 A2 ) ×100 式(1)式中：A1 为静置 30 min 后样品的吸光度;A2 为等体积的乙醇对照的吸光度 ;A3 为待测样品与 DPPH 等体积乙醇吸光度。

　　1.2.3.2 ABTS 自由基清除能力　参照陈青青等[11] 方法，分别取样品 0.1 mL 样品(浓度 2%)，加入 5 mL ABTS+ ·工作液静置 10 min，734 nm 测吸光度，以 0.1 mL 乙醇作为对照。ABTS 自由基清除率按式(2)计算; ABTS自由基清除率(%) = AS −Am AS ×100 式(2)式中：AS 为乙醇对照组吸光度;Am 为样品吸光度。

　　1.2.3.3 羟自由基清除能力　参照封燕等[12] 的方法稍作改动，分别取样品 0.1 mL 样品(浓度 2%)，依次加入 1 mL 6 mmol/L FeSO4 溶液、1 mL 6 mmol/L 水杨酸-乙醇溶液和 1 mL 6 mmol/L H2O2 溶液，于 37 ℃ 水浴 30 min，510 nm 测吸光度，以 0.1 mL 蒸馏水代替样品作为对照组。羟自由基清除率按式(3)计算;羟自由基清除率(%) = ( 1− Ai −Aj A0 ) ×100 式(3)式中：Ai 为待测样品吸光度;Aj 为对照组吸光度;A0 为双蒸水代替 H2O2 溶液作为底物对照的吸光度。

　　1.2.3.4 T-AOC 的测定　采用 T-AOC 检测试剂盒进行分析。 1.2.4 绿豆皮黄酮类化合物的结构分析　称取 10 mg 冻干后的样品粉末，加甲醇 10 mL 溶解，10000 r/min 离心 15 min，取上清液用于测试。使用 0.1% 甲酸乙腈为流动相，流速为 0.5 mL/min，检测波长 280 nm。采用 waters T3 色谱柱(50 mm×3.0 mm i.d. ,1.8 μm)，进样量 5 μL，柱温箱 40 ℃。采用 UPLC-Triple-TOF/ MS 系 统 进 行 黄 酮 结 构 测 定 ， 并 根 据 Scifinder 和 Reaxy 数据库检索和推测黄酮类化合物组分。

　　1.3　数据统计分析

　　所得数据均为三次重复的平均值，用 Statistix 8(分析软件, St Paul, MN) 进行数据分析，平均数之间显著性差异(P<0.05)通过 Turkey HSD 进行多重比较分析。并采用 SigmaPlot 12.5 作图。

　　2　结果与分析

　　2.1　绿豆皮黄酮类化合物的分离

　　图 1 反映的是绿豆皮黄酮梯度洗脱样品图。由图可知，绿豆皮黄酮饱和吸附后，采用不同洗脱溶剂等体积洗脱制备得到的绿豆皮黄酮级分浓度不同，随着洗脱剂乙醇浓度的增强，洗脱样品的颜色也逐渐变深，其中 60% 洗脱样品颜色最深，表明 60% 洗脱样品中得到的溶质相对较多，80% 醇洗液在连续分离中既可将分离柱中的剩余组分洗脱下来，还可起到清洗分离柱的效果，以保证分离柱的下一轮吸附洗脱。图 2 反映的是绿豆皮黄酮梯度洗脱四个级分的得率。由图可知，四种洗脱溶剂得到的黄酮类化合物浓度分别为 0.0056、0.021、0.0257、0.0044 mg/mL，与图 1 结果结合分析得出，绿豆皮黄酮类化合物集中在 40% 和 60% 洗脱样品中，达到绿豆皮黄酮粗提物的 80% 以上;其中 60% 洗脱样品浓度最高;20% 醇洗液由于极性相对较低，洗脱液中含量较低;由于绿豆皮黄酮类化合物集中在 40% 和 60% 洗脱样品中，因而 80% 醇洗液中样品也较低。结合图 1 和图 2 也可以看出绿豆皮黄酮类化合物组分集中在 40%~ 60% 醇洗液中。

　　2.2　不同级分绿豆皮黄酮的抗氧化能力

　　图 3 反映的是梯度洗脱后不同级分绿豆皮黄酮的抗氧化能力。由图可知，等浓度的各个洗脱级分的 DPPH·、ABTS+·、·OH 清除能力和总抗氧化能力不同，20%、80% 洗脱级分的抗氧化能力最低，60% 洗脱级分的抗氧化能力显著强于其他洗脱级分(P<0.05)，与未分级样品相比，60% 洗脱级分的 ABTS+·、·OH 清除能力和总抗氧化能力显著高于等浓度的黄酮粗提物(P<0.05)，但 DPPH·清除能力显著低于黄酮粗提物(P<0.05)，这说明洗脱样品中的组分与未分级绿豆皮黄酮粗提物存在不同，不同的抗氧化组分其作用效果及机理不同，这与自由基种类也存在一定的相关性，ABTS+ ·和·OH 属于带电荷的自由基，而 DPPH· 却并不带电荷，所以抗氧化效果不同;40% 洗脱级分尽管抗氧化能力强于 20% 和 80% 洗脱样品，但显著低于 60% 洗脱级分(P<0.05)，这也表明不同洗脱样品中的组分不同，因此抗氧化能力不同，也表明绿豆皮黄酮中主要抗氧化组分集中在 60%洗脱液中。

　　2.3 60% 醇洗脱绿豆皮黄酮类化合物结构分析

　　图 4 反映的是 60% 醇洗样品的液相色谱图，由图可知，纯化后绿豆皮黄酮样品中的吸收峰主要有 3 个，分别出现在 4.59、6.06 和 6.20 min，说明 60% 醇洗脱液中绿豆皮黄酮类化合物主要含有 3 种物质。 2.3.1 成分Ⅰ分析 图 5 是成分 I 的一级二级质谱图和可能的结构式。该化合物的出峰时间为 4.59 min， [M-H]−为 449.1107，根据高分辨质谱结果拟合的分子式为C21H22O11，根据二级质谱[M-90-H]、[M-120-H] 等碎片离子，该化合物为碳苷，且含有六元糖，根据 cifinder 和 reaxy 数据库检索，推测该化合物为圣草酚-6-C-β-D-吡喃葡萄糖苷(eriodictyol-6-C-β-D-glucopyranoside)。

　　2.3.2 成分Ⅱ分析 图 6 是成分 II 的一级二级质谱图和可能的结构式。该化合物的出峰时间为 6.06 min， [M-H]−为 431.0992，根据高分辨质谱结果拟合的分子式为C21H20O10，根据二级质谱[M-90-H]、[M-120-H]等碎片离子，该化合物的为碳苷，且含有六元糖，根据 Scifinder 和 Reaxy 数据库检索，根据保留时间分析，推测该化合物为牡荆素(vitexin)。

　　2.3.3 成分Ⅲ分析 图 7 是成分 III 的一级二级质谱图和可能的结构式。该化合物的出峰时间为 6.20 min，[M-H]−为 431.1007，根据高分辨质谱结果拟合的分子式为 C21H20O10，根据二级质谱 [M-90-H]、 [M-120-H] 等碎片离子，该化合物的为碳苷，且含有六元糖，根据 Scifinder 和 Reaxy 数据库检索，推测该化合物为异牡荆素(isovitexin)。

　　3　讨论与结论

　　本研究结果表明，绿豆皮较强的抗氧化活性与其富含黄酮类化合物有关。罗磊等和 Kanatt 等[9,13] 的研究表明，绿豆皮比仁核具有较强的抗氧化性，这是由于皮壳中含有较高的黄酮类化合物。Li 等[14] 的研究发现荞麦皮壳中含有较高的黄酮类化合物，其主要黄酮类物质是牡荆素和异牡荆素，这两种组分被认为是最主要的抗氧化剂。有研究表明绿豆具有清热解毒作用是由于其活性部位提高了机体对氧自由基的清除能力，减轻了过量的氧自由基引起的机体损伤[15−17]。本研究通过连续制备色谱分离纯化得出的抗氧化活性组分经鉴定推测出其主要含有牡荆素、异牡荆素和圣草酚-6-C-β-D-吡喃葡萄糖苷。牡荆素和异牡荆素具有较高的抗氧化能力已被很多研究所证实，牡荆素能保护 DNA 氧化损伤，使细胞免受·OH 诱导的氧化损伤，降低 CSHFD 小鼠肝脏脂肪沉积，减轻脂质代谢，抑制肝脏炎症反应。此外，牡荆素可显著降低肝巨噬细胞浸润，明显下调肝 SREBP-1c、 FAS、ACC mRNA 和蛋白表达[18−19]。异牡荆素可通过抑制机体的氧化反应改善顺铂诱导的肾损伤[20]。黄酮类化合物的 B 环是其清除自由基的主要活性部位，当该环存在邻酚羟基结构时，抗氧化活性增强。潘国庆等[21] 的研究表明，B 环上有邻位羟基，自由基清除能力会显著增强，如槲皮素比山萘素的 B 环上多了一个邻位羟基，其活力显著增强。胡栋宝等[22] 的研究发现，黄酮类化合物的 B 环上含有邻位羟基容易形成分子内氢键，这有利于分散苯氧自由基上的单电子，此种结构具有较高的抗氧化活性[23]。本研究推测的另外一种成分圣草酚-6-C-β-D-吡喃葡萄糖苷的 B 环上有一个邻位羟基，由此，除了牡荆素和异牡荆素这两种抗氧化组分外，这可能是 60% 洗脱样品中绿豆皮黄酮具有较强抗氧化能力的另外一个原因。本文对绿豆加工副产物中绿豆皮的黄酮类化合物进行了提取及分离纯化，鉴定出绿豆皮黄酮中具有较强抗氧化能力的 3 个组分结构，这为绿豆加工副产物资源的利用提供了理论依据。