海水环境下巴氏芽孢杆菌驯化及钙质砂固化效果研究

　　摘 要：为了提升 MICP 技术在海洋环境下对钙质砂的加固效果，在以往研究的基础上，设计进行了人工海水环境下巴氏芽孢杆菌多梯度人工驯化培养试验，并结合 MICP 固化钙质砂柱的力学试验和微细观结构分析，对巴氏芽孢杆菌的驯化效果进行了综合评价。结果表明：(1)海水环境下五梯度驯化后细菌的菌液浓度可达到淡水环境的 97%以上，其与胶结液作用后碳酸盐的生成量较淡水环境下有一定幅度提高;(2)驯化后的巴氏芽孢杆菌具有很好的温度适应能力，在 10～30 ℃温度下均有较好的 MICP 性能;(3)海水环境下加固的钙质砂柱无论是碳酸盐生成量还是无侧限抗压强度均较未驯化前高，尤其是五梯度驯化后的细菌，驯化后的细菌菌体变小，在海水环境生成的碳酸盐(碳酸钙和碳酸镁)晶体更小，更加致密，能更好地填充钙质砂颗粒的孔隙并胶结相邻的钙质砂颗粒，具有更优异的 MICP 性能。相关研究思路和方法可为 MICP 技术在海洋环境钙质砂地基加固方面的研究与应用提供参考。

　　关 键 词：海水加固;梯度驯化;钙质砂;巴氏芽孢杆菌;微生物诱导碳酸盐沉积

　　肖瑶; 邓华锋; 李建林; 程雷; 朱文熙， 岩土力学 发表时间：2021-11-26

　　1 引 言

　　钙质砂作为一种碳酸钙含量极高的特殊岩土体介质，是我国南海岛礁的重要组成部分。在岛礁的工程建设过程中，钙质砂地基的加固处理是一项重要的任务[1-2]，直接影响工程的长期安全。目前岛礁地基土的处理方式主要有注浆法、桩基础处理法、振冲挤密法等，这些方法在一定程度上可以改善地基土的工程特性，但岛礁所处位置远离陆地，材料运输成本巨大[3]。若能就地利用岛礁及其周围环境的材料对地基土进行加固，将很大程度上节约经济成本，且具有较好的环境相容性。

　　基于交叉学科的 MICP 技术近年来发展迅速，在岩土工程领域有着越来越多的研究与应用，如砂土地基加固[4-6]、地基液化防治[7-8]、污染土治理[9-10]、沙漠地区砂土抗风蚀[11-12]等，其中，基于 MICP 技术加固钙质砂的研究也是热点方向。目前关于钙质砂的加固研究主要集中在淡水环境下的加固[13-16]，加固后的钙质砂柱物理力学性能有着较大幅度的提升，其无侧限抗压强度可以达到 MPa 级别以上。近年来，为了更好地将微生物加固技术应用到钙质砂工程中，一些学者根据钙质砂实际赋存环境，开展一些海水条件下的加固研究。典型的如李昊等[17]模拟海水环境对钙质砂进行固化研究，结果显示海水试样的无侧限抗压强度达到淡水试样的 2.66 倍;彭劼等[18]同样对海水环境下 MICP 技术加固钙质砂的效果进行了研究，其结论是海水环境会抑制 MICP 过程中碳酸钙的最终生成量，进而使得海水环境下加固的钙质砂柱的无侧限抗压强度低于淡水环境;此外，余振兴[19]、董博文[20]等利用天然海水进行微生物培养并对钙质砂进行加固，发现天然海水使微生物的生长出现滞后期。上述学者在海水环境下对钙质砂的加固研究表现出不同的加固效果，出现这种差异的主要原因是用于加固适用的细菌对海水环境的适应性不同所导致。目前的研究中，通常是直接采用巴氏芽孢杆菌或其他矿化细菌在海水环境下对钙质砂进行加固，这就需要细菌在海水环境条件下能够较好地生存繁殖，且具备良好的产脲酶能力，其本质是矿化细菌能较好的适应海水环境，但这方面的研究成果还鲜有报道。

　　利用海水环境对钙质砂进行加固，不仅可以大幅降低海水淡化的成本，同时可以使矿化细菌更好地适应海水环境并进行 MICP 过程加固钙质砂。因此，如何使矿化细菌在海水环境下正常的生长繁殖并使得其对钙质砂的加固效果达到甚至超过淡水环境，是本文研究的重点。那么如何使微生物适应海水环境呢?本文拟借鉴生物学研究领域的一种方法，即微生物驯化来达到这一目的。微生物驯化，也即驯化微生物的行为，是指在细菌培养基中加入靶向环境的材料或基质，让细菌适应并依赖靶向环境的材料或基质，从而使其在靶向环境中也能表现出较好的生长趋势和工作特性[21-24]。为了使巴氏芽孢杆菌更好地在海水环境下进行 MICP 过程，本文采取人工驯化的方法对其进行驯化，通过制备人工海水，研究不同驯化方案对菌液浓度、碳酸钙生成量、固化砂柱的力学性能等方面的影响，通过对比得到合适的驯化方案和驯化后的巴氏芽孢杆菌菌种，为将 MICP 技术更好地应用到海水环境下的钙质砂加固提供参考。

　　2 海水环境下巴氏芽孢杆菌的驯化

　　2.1 海水环境下巴氏芽孢杆菌驯化方案

　　本文选取巴氏芽孢杆菌(Sporosarcina pasteurii，编号：ATCC 11859)作为进行海水环境下人工驯化培养的菌种。根据标准 ASTM D1141-98(2013)[25]中海水替代品的化学组成成分和物质含量可知，组成人工海水、含量较多的前 10 种化合物为 NaCl、MgCl2、 Na2SO4、CaCl2、KCl、NaHCO3、KBr、H3BO3、SrCl2、 NaF。上述化合物的含量如表 1 所示。按表中数据进行人工海水的配置，其盐度为 35‰，pH 值约为 8.2。

　　根据相关微生物驯化研究的方法和思路[21-24]，本文拟采取直接驯化、三梯度驯化和五梯度驯化等 3 种驯化方案对巴氏芽孢杆菌进行海水环境的驯化研究。驯化培养基的配制方法如下：首先，根据表 1 所示的物质成分和含量配置人工海水，用去离子水等体积替代海水，制得不同浓度的人工海水;然后，在不同浓度的人工海水中，参考以往研究经验[26-28]，分别加入蛋白胨 10 g/L、牛肉膏 3 g/L、氯化钠 5 g/L、尿素 60.06 g/L 等 4 种培养基的组成物质，制得不同海水浓度下的驯化培养基。驯化试验方案如表 2 所示，不同的梯度驯化方案下驯化流程如图 1 所示。

　　根据表 2 和图 1 所示，具体的驯化流程如下：

　　(1)直接驯化：将 1 mL 巴氏芽孢杆菌加入到盛有100 mL人工海水的驯化培养基的锥形瓶A中，摇床 30 ℃、180 r/min 培养 48 h 后取出，即完成直接驯化，此时锥形瓶 A 中的细菌即为直接驯化的细菌。

　　(2)三梯度驯化：将 1 mL 巴氏芽孢杆菌加入到盛有 100 mL 1/3 海水浓度的驯化培养基的锥形瓶 B 中，培养 48 h 后取出备用;将锥形瓶 B 中 1 mL 菌液加入到盛有 100 mL 2/3 海水浓度的驯化培养基的锥形瓶 C 中，培养 48 h 后取出备用;将锥形瓶 C 中 1 mL 菌液加入到盛有 100 mL 海水浓度的驯化培养基的锥形瓶 D 中，培养 48 h 后取出，即完成三梯度驯化，此时锥形瓶 D 中的细菌即为三梯度驯化的细菌。

　　(3)五梯度驯化：将 1 mL 巴氏芽孢杆菌加入到盛有 100 mL 1/5 海水浓度的驯化培养基的锥形瓶 E 中，培养 48 h 后取出备用;将锥形瓶 E 中 1 mL 菌液加入到盛有 100 mL 2/5 海水浓度的驯化培养基的锥形瓶 F 中，培养 48 h 后取出备用;将锥形瓶 F 中 1 mL 菌液加入到盛有 100 mL 3/5 海水浓度的驯化培养基的锥形瓶 G 中，培养 48 h 后取出备用;将锥形瓶 G 中 1 mL 菌液加入到盛有 100 mL 4/5 海水浓度的驯化培养基的锥形瓶 H 中，培养 48 h 后取出备用;将锥形瓶 H 中 1 mL 菌液加入到盛有 100 mL 海水浓度的驯化培养基的锥形瓶 J 中，培养 48 h 后取出，即完成五梯度驯化，此时锥形瓶 J 中的细菌即为五梯度驯化的细菌。

　　另外，在每一级海水浓度的驯化过程中，对该海水浓度下的细菌进行多次扩大培养并测量菌液浓度，直至前后 2 次培养得到的菌液浓度不再变化之后，进行下一个海水浓度的驯化过程，以三梯度驯化为例，详细的驯化过程如图 2 所示。

　　2.2 驯化过程中巴氏芽孢杆菌菌液浓度变化

　　为了分析驯化过程中细菌浓度的变化情况，对不同驯化方案，在每级海水浓度下的扩大培养过程中，采用分光光度计(采用 600 nm 的波长)测定菌液的吸光度，根据 OD600 值来表示菌液浓度[29-30]。 3 种驯化方案下，每一级海水浓度下细菌的初始阶段和培养达到稳定阶段的菌液浓度如图 3 所示。

　　由图 3 可知，不同驯化方案对巴氏芽孢杆菌的驯化效果明显不同：

　　(1)直接驯化方案下，菌液浓度明显较低，即使经过多次扩大培养，其提升幅度有限，表明高浓度的海水环境对巴氏芽孢杆菌的生长繁殖有明显的抑制作用。

　　(2)对于三梯度和五梯度驯化方案，每一级海水浓度的驯化过程中，驯化初始阶段的菌液浓度均相对较低，经过该海水浓度下的多次扩大培养后，菌液浓度迅速并逐渐趋于稳定，而且海水浓度越低，提升的幅度越明显。

　　(3)在梯度驯化过程中，随着海水浓度的逐级提升，驯化达到稳定阶段的菌液浓度呈逐渐降低的趋势。这是因为随着海水浓度的提升，渗透压力逐渐增大，随着驯化过程的进行，虽然巴氏芽孢杆菌对渗透压升高有一定的适应能力，但高渗透压势必会对细菌生长繁殖产生一定的影响，因此，每级驯化完成之后，其菌液浓度均会低于上一级海水浓度下的菌液浓度。

　　(4)三梯度和五梯度驯化完成后，菌液浓度分别为 0.612 和 0.652，可以达到淡水环境下相当的水平，说明梯度驯化下，细菌能较好地逐步适应海水环境。

　　2.3 驯化过程中巴氏芽孢杆菌诱导生成碳酸盐产量变化

　　De Muynck 等[31]、彭劼等[32]研究发现温度对巴氏芽孢杆菌的生长趋势和 MICP 性能影响较大，在 10～ 37 ℃范围左右尤为明显。在试验过程中，为探讨温度对驯化后巴氏芽孢杆菌 MICP 性能的影响，考虑海水温度条件，试验中考虑了 10 ℃和 30 ℃两种情况。对不同驯化培养方案下 MICP 作用后碳酸盐的生成量进行测定，具体流程如下：

　　(1)对不同海水浓度驯化培养方案下的细菌进行扩大培养，180 r/min、48 h 后取出备用[33]。

　　(2)分别取不同驯化培养方案下的菌液各100 mL，加入到盛有 0.5 mol/L 300 mL 胶结液(充足的胶结液，1.0 mol/L CaCl2 溶液和 1.0 mol/L 尿素溶液等体积混合)的锥形瓶中充分混合，置于 10 ℃或 30 ℃ 的电热恒温保温箱中保温 48 h，使得菌液与胶结液充分反应。

　　(3)48 h 后取出锥形瓶，将锥形瓶中生成的碳酸盐倒入培养皿中，烘干后称取碳酸盐生成量。

　　不同驯化方案下碳酸盐生成量如图 4 所示，由图可以看出：

　　(1)直接驯化方案中，两种温度条件下碳酸钙生成量较驯化前(即未驯化的巴氏芽孢杆菌在淡水环境下的 MICP，后文统一简称驯化前)大幅度降低，仅占驯化前碳酸钙生成量的 2.62%～3.92%，说明巴氏芽孢杆菌对海水环境适应能力较差，MICP 过程受到了明显的抑制，这与彭劼等[18]得到的试验规律是一致的。三梯度驯化后，碳酸钙的生成量较驯化前增加了 6.68%～16.82%，五梯度驯化后，碳酸钙的生成量较驯化前增加了 12.59%～22.79%，说明梯度驯化过程下，巴氏芽孢杆菌对海水的适应能力逐渐增强，而且由于海水中的钙离子、镁离子可以提供更多的钙源/镁源，使得碳酸盐的生成量较淡水环境下有一定幅度的提高。

　　(2)比较两种温度条件下的碳酸钙生成量可以发现，驯化前，10 ℃和 30 ℃碳酸盐生成量差别为 7.75%，这与以往研究得到的温度对 MICP 的影响规律是一致的[32]。三梯度和五梯度驯化后，10 ℃ 和 30 ℃碳酸盐生成量的差别逐渐减小为 1.64%、 1.21%，说明梯度驯化之后，温度对 MICP 的影响明显减弱。也即，驯化之后的细菌不仅能适应海水环境，而且具有更好的温度适应性。

　　3 海水驯化巴氏芽孢杆菌对钙质砂的加固效果研究

　　3.1 钙质砂的物理特性

　　试验所用钙质砂颗粒密度约为 2.70～2.85 g/cm3，过筛前的钙质砂如图 5 所示。为优化加固效果，使用土工标准筛对其进行筛分，按照不同的粒径和比例进行配制，本试验所采用的钙质砂颗粒分布曲线如图 6 所示。在对钙质砂进行加固前，依次采用 0.1 mol/L 的 HCl 溶液和 0.1 mol/L 的 NaOH 溶液分别对其浸泡 12 h，进行前处理[34]，浸泡结束后用去离子水清洗并烘干备用。

　　3.2 驯化巴氏芽孢杆菌对钙质砂加固效果试验研究方案

　　根据巴氏芽孢杆菌的驯化试验结果，直接驯化方案下菌液浓度过低，因此，本节的砂柱加固试验中仅考虑采用三梯度和五梯度驯化完成后的巴氏芽孢杆菌，分析研究两种梯度驯化细菌在海水环境对钙质砂的加固效果。另外作为对照，采用未驯化的巴氏芽孢杆菌进行钙质砂在淡水环境下的加固，具体试验方案如表 3 所示。

　　钙质砂的加固采用浸泡法[17]进行。具体加固流程如下：

　　(1)将钙质砂分层装入自制柔性多孔模具中(如图 7 所示)，每层稍振捣密实，层与层之间进行打毛处理，试样制备完成后，将去离子水从装好钙质砂试样顶部注入，以排除钙质砂颗粒间空气。(2)将 80 mL 菌液注入砂样，静置 12 h，待菌液充分附着在钙质砂颗粒表面。

　　(3)将 80 mL 1 mol/L CaCl2 溶液和 80 mL 1 mol/L 尿素溶液等体积混合配制成 0.5 mol/L 160 mL 胶结液(胶结液的配置根据加固方案分为人工海水配置的胶结液和去离子水配置的胶结液)，注入砂样中，静置 3 d 后让废液从模具底部流出。

　　(4)步骤(2)、(3)为 1 次加固过程，反复进行 10 次对钙质砂进行加固处理。

　　(5)拆除模具底部固定套，将试样倒置并重复步骤(2)、(3)，再次进行 10 次加固。

　　(6)拆除侧壁模具，将试样放入烘箱中 60 ℃ 烘干至恒重再进行后续相关的宏观物理力学试验及微观测试研究。

　　胶结完成后典型的钙质砂柱如图 8 所示。首先对固化好的钙质砂柱采用加固前后质量差法对碳酸盐的含量进行测试。然后将钙质砂柱端部打磨平整， 采用 RMT-150C 岩石力学试验系统对试样进行无侧限抗压强度试验，加载速率为 0.01 mm/s，直至试样破坏。

　　3.3 海水驯化芽孢杆菌对胶结钙质砂柱力学性能的影响

　　3.3.1 不同方案下钙质砂柱中碳酸盐含量

　　相关研究表明，当碳酸钙生成量高于 60 kg/m3 时，砂柱的强度会得到显著提高[35]，因此碳酸钙的生成量可用来评价胶结效果好坏。普通硅质砂固化体中沉积的碳酸钙通常采用酸洗的方法进行测量[36]，但钙质砂本身的碳酸钙含量较高，故不宜采用酸洗法，因此，本文采用加固前后钙质砂柱的质量差作为生成碳酸盐的质量，不同加固方案下钙质砂柱中碳酸盐含量如图 9 所示。

　　由图 9 可以看出：

　　(1)海水环境下，三梯度或五梯度驯化后的巴氏芽孢杆菌加固的钙质砂柱中碳酸盐的生成量均超过 18%(由 60 kg/m3 经计算转化而来)，表明钙质砂柱的强度得到了显著的提高。

　　(2)海水环境下加固钙质砂柱中碳酸盐含量高于淡水环境，与对照组相比，三梯度驯化组和五梯度驯化组砂柱中碳酸盐生成量分别高 19.67%和 25.86%，比较而言，五梯度驯化后细菌产生的碳酸盐更多。与文献[20]相比，在海水配置的胶结液浓度为 0.5 mol/L 时，砂柱中碳酸盐生成量最多为 14%，本文相同的胶结液浓度下碳酸盐含量均在 20%以上，表明驯化后的细菌能更好的适应海水环境，从而生成更多具有胶结作用的碳酸盐。

　　3.3.2 不同方案下钙质砂柱无侧限抗压强度

　　不同方案下砂柱破坏形态如图 10 所示。图 10 显示不同方案下砂柱破坏模式基本一致，均有一条从顶部扩展的主裂纹及若干小裂纹，没有局部破坏情况，表明试样均匀性较好。

　　不同方案下钙质砂柱典型的无侧限抗压强度曲线如图 11 所示。

　　由图 11 可以看出，不同方案下钙质砂柱的轴向变形-无侧限抗压强度曲线走势基本一致，曲线在达到峰值强度之前近似呈直线上升，达到峰值强度之后强度逐渐降低，表现出明显的屈服阶段和峰后软化阶段。驯化前钙质砂柱无侧限抗压强度平均值为 2.57 MPa，三梯度驯化后强度提高了 20.86%～36.78%，五梯度驯化后强度提高了 38.17%～58.19%，其中，五梯度驯化组钙质砂柱的无侧限抗压强度达到了 4 MPa。

　　无侧限抗压强度与碳酸盐的生成量具有一致性，碳酸盐生成量越高，对钙质砂柱颗粒间的孔隙和钙质砂本身的孔隙填充、对砂颗粒间的胶结作用更好，固化效果更好，砂柱的均匀性更高，因而砂柱的强度更高。文献[17]中利用巴氏芽孢杆菌在模拟海水环境下固化钙质砂，砂柱的无侧限抗压强度最大约为 1.75 MPa。本文试验砂柱的无侧限抗压强度更高，表明驯化后的巴氏芽孢杆菌对钙质砂的固化效果更好。

　　4 海水驯化巴氏芽孢杆菌加固钙质砂机制

　　为了分析驯化过程对 MICP 加固效果的影响机制，特对不同加固方案下钙质砂柱进行 SEM 电镜扫描和 EDS 能谱测试。以对照组和五梯度驯化为例，取无侧限抗压试验破坏后的试块进行 SEM 扫描分析，分别放大 100 倍和 500 倍的 SEM 照片如图 12 所示，相应 EDS 能谱图如图 13 所示。

　　结合图 12、13 可以看出，采用未驯化的巴氏芽孢杆菌在淡水环境下对钙质砂加固后，生成物元素组成为 Ca、O 和 C，即表明生成物主要为碳酸钙。较多的碳酸钙“生长”并填充在钙质砂颗粒之间的空隙处，而且聚集堆积的碳酸钙晶体较大，同时，钙质砂颗粒表面的孔隙也被生成的碳酸钙逐渐封堵。五梯度驯化后的巴氏芽孢杆菌在海水环境下对钙质砂加固后，生成物的元素组成不仅有 Ca、O 和 C，还有 Mg 和 Cl(有 Cl 可能是因为生成物表面附着有海水)，表明生成物至少有碳酸钙和碳酸镁两种碳酸盐。孙潇昊等[37]研究表明，碳酸镁固化成型的固化体强度高于碳酸钙固化体，这也是海水环境下加固钙质砂柱的无侧限抗压强度高于淡水固化的原因之一。

　　另外一个明显的现象是，采用驯化后的巴氏芽孢杆菌对钙质砂进行加固时，颗粒空隙内生成的碳酸盐晶体较小，颗粒间胶结情况更加紧密，颗粒表面孔隙被封堵的效果更好。采用光学显微镜对驯化前、后的菌体进观察(如图 14 所示)，发现驯化后的菌体与驯化前相比明显减小，这也是造成生成的碳酸盐矿物晶体小而致密的原因。

　　总体来说，驯化后的巴氏芽孢杆菌在人工海水环境下对钙质砂加固的影响机制主要表现在以下 3 个方面：①梯度驯化可以使细菌逐步适应海水环境，保持较好的生长繁殖能力，分泌具有较高活性的脲酶进行 MICP 作用;②由于胶结液中含有 Ca2+和Mg2+等，在加固过程中使得细菌诱导产生 CaCO3 和 MgCO3 沉淀，在这两种碳酸盐作用下钙质砂柱得到很好的固化;③驯化后的巴氏芽孢杆菌菌体形态明显减小，使得在 MICP 过程中形成更小、更为致密的碳酸盐矿物晶体。在上述 3 个方面的共同作用下，松散的钙质砂胶结形成砂柱，其无侧限抗压强度较淡水环境中加固的钙质砂柱有明显提高。

　　5 结 论

　　本文采用人工驯化的方式对巴氏芽孢杆菌进行海水环境下的驯化，通过系列试验研究了驯化细菌对钙质砂加固效果。主要结论如下：

　　(1)对比直接驯化、三梯度驯化和五梯度驯化等 3 种方案发现，海水环境会抑制细菌的生成及其脲酶的合成，采用梯度驯化可以使细菌逐步适应海水环境，而且具有更好的温度适应性。比较而言，五梯度驯化后的细菌较三梯度驯化后的细菌更具优势，其菌液浓度可达到驯化前的 97%以上，不同温度下碳酸盐生成量较驯化前提升了12.59%～22.79%。

　　(2)三梯度和五梯度驯化组钙质砂柱的无侧限抗压强度分别最高可达约 3.5MPa 和 4.0MPa，较淡水环境下分别提高了 20.86%～36.78%和 38.17%～ 58.19%，说明巴氏芽孢杆菌的梯度驯化方法是可行的，驯化后的巴氏芽孢杆菌可以有效地提升钙质砂的加固效果，而且梯度驯化的影响也非常明显。

　　(3)梯度驯化后的巴氏芽孢杆菌菌体形态明显减小，具有良好的海水环境适应性。同时，海水环境能够为 MICP 作用提供更多的钙离子和镁离子，进而促进了胶结固化过程中碳酸盐的生成，提高了固化砂柱的强度。