夹板外固定与散巴布剂对桡骨骨折模型兔骨愈合的影响

　　摘要背景：目前临床治疗长骨骨折的主要手段是石膏或夹板外固定及接骨板或者髓内钉等内固定，同时也可服用加速骨折愈合的药物或者在患处外敷药物。目的：探讨夹板外固定联合散巴布剂对于桡骨骨干骨折的恢复是否有改善作用。方法：取18只新西兰大白兔，制作左侧桡骨完全性骨折模型，分成3组，未干预组不进行任何干预，夹板固定组用夹板外固定处理，散巴布剂组使用夹板外固定处理并辅助散巴布剂药物外敷(每天换药一次)，每组6只。术后2，4，6周，取骨痂位置制备样品，应用原子力显微镜检测骨痂粗糙度和颗粒度。结果与结论：①夹板固定组、散巴布剂组可以明显观察到骨痂的粗糙表面和明显的颗粒结构，这些矿物颗粒附着在胶原纤维上，呈现出鱼鳞状，其中散巴布剂组的胶原结构远远小于夹板固定组;②随着愈合时间的增长，骨痂矿物颗粒尺寸逐渐减小，散巴布剂组同期骨矿化颗粒尺寸较夹板固定组小47.5%-69.6%;同时随着愈合时间的推移骨痂粗糙度逐渐降低，散巴布剂组术后2周的骨痂粗糙度较夹板固定组小约 69%，术后6周两组骨痂粗糙度趋于近似;③结果表明散巴布剂对骨折愈合具有促进作用。

　　关键词：散巴布剂;夹板;骨折愈合;原子力显微镜;粗糙度;颗粒度

　　李睿; 史文; 杨士彩; 吕林蔚; 张春秋， 中国组织工程研究 发表时间：2021-11-25

　　0 引言 Introduction

　　长骨骨干骨折是常见于外界暴力冲击造成的创伤性骨折 [1]，目前临床上的主要治疗手段是石膏固定或夹板固定等外固定，以及接骨板或者髓内钉等内固定 [2-5]。使用外固定治疗手段一般还会同时服用加速骨折愈合的药物或者在患处外敷药物。详细分析药物对骨折愈合的影响作用，对临床选择合适的治疗方案具有重大意义。夹板外固定联合散巴布剂外敷是当前中医治疗长骨骨折主要的治疗手段。夹板固定减轻了患者植入内固定假体的术中风险与术后痛苦，同时散巴布剂外敷又能够有效促进骨折区域的成骨作用，加速骨折愈合。散巴布剂的主要成分为三七总皂苷与血竭素，其中血竭素有化瘀止血的功效，主要用于骨折位置皮肤的消肿 [6-8];三七总皂苷能够促进成骨细胞的增殖和分化 [9-12]，对骨髓间充质干细胞的凋亡有抑制作用，对血管新生也有促进作用 [13-14]。

　　表征骨折愈合的手段有透射电子显微镜和扫描电子显微镜等方法，这些方法可以对胶原蛋白和矿物质成分的骨基质进行高分辨率成像 [15]，然而这两种技术都有很大的局限性，对样品的制备比较苛刻。原子力显微镜也是一种高分辨率成像方式，相较透射电子显微镜或扫描电子显微镜的破坏性更小。使用原子力显微镜成像观察的样品可以保持完整，并且可以在空气或液体中、室温或培养条件下成像，这意味着测量的特性是样品的特征，加工或成像的伪影可能性较小。原子力显微镜可以清晰地描述纳米尺度下骨痂的表面形貌，主要表征形式为骨组织表面的粗糙度和颗粒度，用精确定量方法来评估骨的纳米级特性。目前针对散巴布剂促进骨折愈合在纳米尺度的表现形式仍然鲜有报道。在纳米级表征骨痂有助于人们进一步理解散巴布剂在促进骨折愈合方面的功效。实验拟采用新西兰大白兔进行骨折愈合康复模拟，通过对比分析夹板外固定愈合与夹板外固定愈合辅助散巴布剂外敷治疗方案中骨痂纳米的形态，得出散巴布剂对骨折愈合的促进作用。

　　1 材料和方法 Materials and methods

　　1.1 实验设计 夹板外固定与散巴布剂促进骨折愈合的动物实验。

　　1.2 时间及地点 动物手术与饲养实验于 2020 年 3-12 月在天津市医药科学研究所完成。骨组织的原子力显微镜扫描实验于 2021 年 1-3 月在天津理工大学完成。 1.3 材料 散巴布剂 ( 天津中医药大学第二附属医院药剂科提供，具体成分保密 )。

　　实验动物：选取 18 只 6 月龄雌性健康新西兰大白兔 [ 实验动物许可证编号：SCXK(Beijing) 2016-0007]，平均体质量 2.5 kg。实验前将所有动物适应性分笼喂养 2 周。动物实验严格按照天津中医药大学实验动物委员会的实验要求执行，批文编号：IMPS-EAEP-Z-2019108-01。

　　1.4 方法 取 18 只新西兰大白兔，臀部肌注速眠新Ⅱ号 ( 盐酸赛拉嗪注射液 )0.15 mL/kg 进行麻醉。双上肢脱毛置于手术台，术区常规碘伏消毒。取左侧桡骨中 1/3 前外侧纵行切口，切口长约 18 mm，切开皮肤及皮下组织暴露桡骨中 1/3 之处。用口腔磨钻横断造成 3 mm 的桡骨完全性骨折，骨折断端不做特殊固定。用生理盐水反复冲洗切口，并逐层缝合，分 3 组处理，每组 6 只：未干预组仅做术后缝合创口并消毒包扎，自然状态生长;夹板固定组术后缝合创口并消毒包扎，使用夹板绑缚处理;散巴布剂组术后缝合创口并消毒，将散巴布剂均匀涂抹于纱布上，平均厚度为 1 mm 左右，随后将纱布包扎在骨折区域，最后用夹板进行绑缚处理，每天换药一次。将兔放入饲养笼内苏醒。术后分笼饲养，给予正常饲料喂养及饮水，术后 3 d 内注射硫酸庆大霉素预防切口感染， 4×104 U/ 次，1 次 /d，观察动物切口愈合情况。手术过程如图 1 所示。

　　1.5 主要观察指标 术后 2，4，6 周时，每组随机选取 2 只兔进行安乐死处理，取左侧桡骨组织。首先利用硬组织切割机在骨痂成型位置沿着骨折线方向将桡骨切割为 2 段，各自形成一个骨折截面。然后分别将 2 段桡骨以垂直骨折截面方向 2 mm 左右位置再次切割，形成厚度约 2 mm 的切片，冷冻保存。切割过程中始终保持循环冷却水辅助降温。配置环氧树脂包埋液混合搅拌至均匀无丝絮状。将切片放置在包埋盒内，倒入包埋液用搅拌棒引流至刚好覆盖切片表面。放置 24 h 后，包埋切片固化完成。利用自行设计的专用夹具对包埋切片进行固定。然后在金相磨抛机上安装 400 目砂纸对包埋切片中含有骨折截面的一侧进行粗磨，至刚好暴露出骨折截面;更换 800 目砂纸细磨，降低表面粗糙度以满足原子力显微镜检测要求。

　　通过使用原子力显微镜探针 (Bruker 公司的 RTESPA-300) 在标准原子力显微镜模式下采集图像，该探针具有 125 µm 的悬臂长度、40 µm 的悬臂宽度、3.4 µm 的悬臂厚度、 40 N/m 的 力 常 数、300 kHz 的 谐 振 频 率。 扫 描 模 式 为 PeakForce QNM in Air，扫描速率为 0.4 Hz，峰值力振幅为 150 nm，纵横比为 1.0。扫描完成后进行压平处理，对样品中出现的明显的曲面或斜面进行压平，即对图像进行一阶平坦化处理，再使用 NanoScope Analysis 软件测量粗糙度与颗粒度。平均粗糙度定义为给定区域内 z 值的标准偏差。使用以下公式计算：通过原子力显微镜后处理软件 NanoScope Analysis 分析图像，选择感兴趣区得到粗糙度和颗粒度，见表 1 所示。图注：两组均可观察到骨痂的粗糙表面和明显的颗粒结构，这些矿物颗粒附着在胶原纤维上，呈现出鱼鳞状，由黑色椭圆标记;其中固定夹板组在骨痂表面发现大量的胶原纤维结构，散巴布剂组的胶原结构远远小于夹板固定组图 3 |夹板固定组与散巴布剂组术后不同时间点的骨折面峰值力误差图 Figure 3 | Peak force errors of fracture surface in the splintage group and splintage adjuvant Shenxiaosan group at various time points after surgery Rq N ∑(zi -zavg) 2 式中，zavg 为给定区域内 z 值的平均值，zi 为当前 z 值， N 为给定区域内的点数。

　　2 结果 Results

　　通过原子力显微镜扫描观察各组愈伤组织的表面形貌，夹板固定组与散巴布剂组术后 2，4，6 周的三维高度图见图 2 所示。

　　夹板固定组与散巴布剂组术后 2，4，6 周的峰值力误差图见图 3 所示。从图像中可以明显观察到骨痂的粗糙表面和明显的颗粒结构，这些矿物颗粒附着在胶原纤维上，呈现出鱼鳞状，由黑色椭圆标记;其中固定夹板组在骨痂表面发现大量的胶原纤维结构，散巴布剂组的胶原结构远远小于夹板固定组。

　　3 讨论 Discussion

　　目前临床上促进骨折愈合的手段比较多，常见的手段有体外高频低载机械振动加载 [16]、双膦酸盐类口服药物 [17-18]、中药巴布剂外敷等 [19-21]。实验采用固定夹板体外固定，同时在骨折区域敷用散巴布剂促进骨折愈合，这是目前中医领域常见的骨折治疗方案，实验结果显示散巴布剂能够显著促进骨折面的成骨作用，缩短骨折愈合时间。

　　散巴布剂组术后 2，4，6 周骨痂区域的骨矿物颗粒直径中位数分别为 160.7，101.6，52.0 nm，夹板固定组术后 2，4，6 周骨痂区域的骨矿物颗粒中位数分别为 306.3， 209.6，171.4 nm，较散巴布剂组分别高出 90.6%，201.5%， 229.6%。散巴布剂组骨痂区域矿物颗粒尺寸明显小于未干预组，并且散巴布剂组术后 2 周的骨矿物颗粒尺寸与夹板固定组术后 6 周的骨矿物颗粒尺寸非常近似。MILOVANVIC 等 [22]的研究结果显示，骨的纳米力学性能显著依赖于矿物晶体尺寸，其中矿物颗粒尺寸与骨组织的力学性能显著负相关。此外，WALLACE[23] 对合成羟基磷灰石颗粒的研究中也发现较大的晶粒尺寸会降低材料强度。由此可以推断出，从术后的第 2 周开始，散巴布剂组的骨痂强度就与未干预组和夹板固定组愈合时接近了。术后第 6 周时散巴布剂组的骨组织矿物颗粒尺寸已经接近于正常健康骨组织 [24]，这说明应用散巴布剂后骨折面的新生骨组织强度远高于其他组，并且接近于健康状态。从术后取骨大体观测来看，所有分组的骨折面均愈合良好，但是从原子力显微镜影像数据观测来看，只有应用散巴布剂之后骨折面新生骨组织的力学性能才与健康状态相近。术后第 6 周时未干预组和夹板固定组的矿物颗粒直径仍然超高，说明骨折愈合后新生成的骨组织力学性能较差，在术后康复短期内比散巴布剂组更容易出现二次骨折风险。

　　骨痂的粗糙度是判断骨折区域骨重建速率的一个重要指标。MILOVANOVIC 等 [22] 的研究结果显示，骨组织粗糙度越高骨重建进程越活跃。BARKARMO 等 [24] 的实验结果显示，健康大白兔的皮质骨粗糙度均值为 71.7 nm，代表了平稳的骨重建状态。此次实验中 3 组在术后 6 周时的骨痂粗糙度趋于相同水平，均值为 87 nm，略高于健康状态，表明骨折区域已经基本愈合完成;但在 2 周时散巴布剂组的骨痂粗糙度明显小于夹板固定组及未干预组，可以看出散巴布剂在骨折后的 2 周内就已经加快了该区域的骨重建进程，缩短了骨折愈合时间。在第 2 周结束时骨重建进程已经趋于稳定，并且在随后的第 4 周和第 6 周粗糙度没有明显变化，在散巴布剂的作用下骨愈合已经提前完成并维持着稳定正常的骨重建状态;而未干预组和夹板固定组的骨痂粗糙度明显高于散巴布剂组，表明在未干预状态下术后 6 周骨折面仍然没有完全愈合，需要继续保持治疗状态。

　　GAO 等 [16] 进行了间歇性高频低载振动促进骨折愈合的实验，结果显示每天 3 次低频振动对骨折愈合效果最明显，其粗糙度中位数为 79.8 nm。此次实验中散巴布剂组工况骨痂的粗糙度为 62.4 nm，对比可以看出散巴布剂的愈合效果与高频低载振动相似。从愈合的时间进程来看，应用散巴布剂后骨折愈合的时间明显缩短。GAO 等实验愈合开始的时间为 2 周，和此次实验所观察到的愈合时间基本一致，因此可以判断出辅助手段对愈合的起始时间没有太多影响，骨折患者不可以提早下床，辅助手段只是对骨痂愈合质量起到较好的促进作用。在图 3 的峰值力误差图中，每个像素位置的瞬时误差信号通常比高度图表现出更精细的表面特征，从图中可以发现固定宽度的规则痕迹，即是胶原纤维结构。胶原纤维的一个特征是纤维的 D-banding，胶原的 D-banding 产生振荡表面形貌，其特征轴向重复距离为 67 nm[16]。在图 3 中可以清晰看到 67 nm 带状图案，这是典型的胶原纤维特征。骨组织的再生是随着有序胶原纤维形成而发生的。夹板固定组相较散巴 布剂组有更多的胶原纤维裸露，没有被矿化颗粒所填充，由此也可推断出散巴布剂加速了胶原纤维矿化，表现出加速骨折愈合速率的现象;未干预组与夹板固定组在 6 周仍然处于愈合状态。

　　实验分析了散巴布剂促进骨折愈合的作用机制，但是在实验过程中仍然存在一定的局限性：①首先，散巴布剂对骨折的愈合作用仅局限在定性研究，骨折区域的用药剂量没有严格确定。实验过程中散巴布剂均匀敷在骨折患处，敷药厚度为 1 mm 左右，以全部覆盖骨折患处且无溢出为标准。另外，散巴布剂中主要有效成分三七总皂苷的含量也没有进行严格测定，因此无法定量分析三七总皂苷对骨折愈合的促进作用。②其次，将骨痂制样后进行原子力显微镜扫描的过程中仅选取骨痂形态最为突出的区域进行扫描，其采样点并没有覆盖全部骨痂截面，因此基于扫描样本量的分析结果可能会存在一定误差。现存的局限问题将在今后的实验中进行弥补。

　　根据以上散巴布剂促进桡骨骨折愈合的实验结果，以及相关文献的对比分析可以得出以下结论：①虽然手术内固定治疗高龄骨质疏松性骨折的临床疗效更优 [25]，但对于术中、术后并发症风险高的老年患者，需要采用夹板外固定的传统方式进行治疗，散巴布剂可以作为非手术治疗的一种替代方案。②散巴布剂作为有效促进成骨作用的药物，其对骨折面的愈合能够起到良好的促进作用，主要表现为缩短骨折愈合时间、加速胶原纤维矿化，从而让老年患者尽早下床活动，尽可能避免由于长期卧床导致的并发症的发生。相比于体外高频低载振动或者超声波辐射等促进骨折愈合的治疗方案，在骨折复位术后短期内散巴布剂促进骨折愈合的方案更适合于老龄患者。③阿仑膦酸钠片是临床治疗骨质疏松的常用药物，在一定程度上可增加骨折处骨痂，但其对于骨折愈合的作用未被证实 [17]。散巴布剂的主要成分三七皂苷可以通过促进前成骨细胞的成骨分化加快骨折愈合，作为一种在骨折治疗中的新药具有广阔前景。