多种微塑料降解菌的分离及效能研究

　　摘要：从垃圾填埋场渗滤液中分离筛选塑料降解菌并对 3 种微塑料的生物降解特性进行了研究。以聚乙烯、聚丙烯和聚苯乙烯 3 种微塑料为唯一碳源，筛选潜在降解菌，采用形态观察、透射电镜观察以及 16S rRNA 基因序列分析对菌株进行鉴定，通过测定生物量、重量损失、培养液 pH 以及 FTIR-ATR 和 SEM 分析了 3 种微塑料的生物降解特性。根据 16S rRNA 基因序列鉴定，分离的 3 株为 Bacillus sp.，Microbacterium sp.，Chryseobacterium sp.。对 3 种菌株的混合培养物进行了 50 d 的生物降解实验，结果显示，PE、PP、PS 三种微塑料的重量损失分别为 8.7%、 6.3%和 12.5%且 pH 显著下降;FTIR-ATR 显示出现了新的官能团;SEM 观察发现微塑料表面出现侵蚀。

　　关键词：微塑料，垃圾填埋场，菌株分离，生物降解，效能

　　李红羽; 郑永杰; 田景芝， 齐齐哈尔大学学报(自然科学版) 发表时间：2021-11-16

　　近年来，微塑料污染在世界范围内引起了越来越多的关注，已成为一个新兴的研究领域[1]。微塑料被定义为尺寸小于 5 mm 的塑料微粒[2]，由工业过程中塑料碎片以及较大塑料的破裂形成[3]。微塑料占塑料废物的 92.4%[4]，主要包括聚乙烯(PE)、聚丙烯(PP)、聚苯乙烯(PS)、聚氯乙烯(PVC)、聚乳酸、聚酰胺和聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)等[5]。

　　以往的研究者大量考察了微塑料的分布、摄入、归宿、行为、量化及其对生态的影响[6-10]，但对于微塑料清除或修复的方法缺乏深入研究，包括生物降解和塑料聚合物的利用。当前对塑料的处理方式主要是热解和化学催化降解[11-12]。相比之下，微生物降解具有污染小、不产生二次污染等特点，是解决塑料降解问题的一种绿色环保且前景良好的方法[13]。目前塑料微生物降解的研究热点之一是筛选高效降解菌株;同时，对菌株降解塑料机理的深入解析，将会是塑料污染生物修复技术在工程中高效、绿色、低成本应用的重要因素。 Yoshida 等[14]研究了 Ideonella sakaiensis 201-F6 对 PET 的降解，该细菌可以将 PET 作为唯一能源和碳源。Mohan 等[15]的研究表明，Pseudomonas sp.和 Bacillus sp.具有降解溴化 PS 的潜力。Paco 等[16]研究了海洋真菌 Zalerion maritimum 对 PE 颗粒不同培养时间的反应。结果表明，该真菌能够利用 PE，并能降低 PE 微粒的质量和粒径。这些研究表明，在自然界中存在着具有微塑料降解潜力的菌种资源。

　　垃圾填埋场微生物多样性十分丰富[17]，是天然的塑料降解菌株富集场所。因此，本研究拟开展以下研究内容：(1)从垃圾填埋场渗滤液中分离和鉴定降解微塑料的细菌菌株;(2)研究混合菌对微塑料生物降解的影响;(3)通过测定生物量、重量损失、培养液 pH，并利用 FTIR-ATR 以及 SEM 分析聚合物中结构变化来评估细菌对微塑料的生物降解特性。

　　1 实验部分

　　1.1 试剂与仪器

　　磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、七水合硫酸镁、硝酸铵、氯化钠、七水合氯化亚铁、七水合硫酸锌、硫酸镁、胰蛋白胨、酵母提取物、琼脂粉，所有试剂购买自上海阿拉丁生化科技有限公司，均为分析纯试剂。 DL-CJ-1ND2 型超净工作台，北京哈尔仪器制造有限公司;TS-112B 型震荡恒温培养箱，上海善志仪器设备有限公司;台式高速离心机，上海卢湘仪有限公司;LX-B50 L 型高压蒸汽灭菌器，合肥华泰医疗设备有限公司;S-3400 扫描电子显微镜(SEM)，株式会社日立制作所;H-7650 型透射电镜(TEM)，株式会社日立制作所;Specdrum 傅里叶变换红外光谱，美国 PE 公司。

　　1.2 菌株的富集及分离

　　以 PE、PP 和 PS 为供试微塑料，将收集到的垃圾渗滤液样品，用生理盐水稀释 1 000 倍，再将 1mL 的稀释液加到 100mL 的以微塑料聚合物(2 g/L)作为唯一碳源的无机盐液体培养基中，120 r/min、27 ℃培养，并测定菌液在 600 nm 处的吸光度(表示为 OD600)，同时观察菌株对塑料的降解情况。待液体培养基中菌液浓度上升并趋于稳定后，取 1mL 菌液到 100mL 新鲜培养基中进行传代培养，每 7d 进行一次传代，每次传代设置 3 个重复。最后利用平板对富集液进行分离纯化，得到潜在降解菌株的纯培养物。

　　1.3 菌株的观察及鉴定

　　细菌样品固定在 2.5%戊二醛溶液 4 h，去除样品中的杂质，并用 100 mmol/L 磷酸缓冲溶液(pH=7.0)冲洗样品 3 次，每次 15min，用一系列浓度(25%, 50%, 75%, 95%)乙醇溶液脱水，每个浓度处理 20min，最终浸泡在无水乙醇中，采用 TEM 分析细菌形态。将筛选出的 3 株菌送至上海美吉生物医药科技有限公司进行 16S rRNA 基因测序，将测序结果与 NCBI 数据库进行同源性比对分析，并下载同源性高的菌种序列信息，进一步用 MEGA-X 软件进行系统发育分析。

　　1.4 生物降解实验

　　将上述步骤中分离出的 3 种塑料降解菌的纯培养分别接种于灭过菌的 LB 液体培养基中培养，待菌株生长至对数期后，将培养液于离心机中 8 000 r/min 离心 10 min，离心后倒去上清液，加入灭菌的生理盐水再于离心机中 8 000 r/min 离心 10 min，弃去上清液，重复两次，最后一次加入生理盐水分散菌体，稀释菌液至 OD600等于 1.0 左右，以上操作均在超净工作台中进行。分别取活化后的 3 种菌株以及混合后的菌株各 1 mL，分别接种于含有 2 g 微塑料(PE、PP 和 PS)的 100 mL 的无机盐培养基培养液中。以含有微塑料但未接种降解菌的无机盐培养基做为对照，27 ℃，120 r/min 振荡培养 50 d，每组做 3 个平行实验，50 d 后测定菌株的生物量 OD600、重量损失以及培养液 pH，考察生物降解特性。

　　1.5 菌株降解特性的研究

　　为了便于精确测定残留微塑料的失重，通过过滤和筛分从培养基中回收微塑料。用 75%的乙醇清洗微塑料，60 ℃烘干一夜，去除附着在塑料颗粒上的生物膜。通过使用可读性为 0.000 1g 的分析天平来测定残留聚合物的重量，以测定生物降解程度。微塑料的失重率按百分比计算为

　　(初始重量-重量)/初始重量×100%。生物降解过程中聚合物官能团的形成或消失可以通过 FTIR 进行监测。本研究使用配备衰减全反射率(ATR)金刚石晶体附件的 FTIR 光谱分析，回收的微塑料用无菌水冲洗 3 次，再用 75%的乙醇清洗微塑料，以 4 cm-1的分辨率和 4000~500cm -1的频率范围对微塑料颗粒的表面官能团进行表征。

　　经混合菌处理 50 d 后的 3 种微塑料样品用蒸馏水洗涤 3 次，再用 75%乙醇冲洗，去除表面的细菌，使最大表面暴露出来，以便观察。在 25mA、0.3MPa 氩气气氛下溅射金微塑料涂层，采用 SEM 进行监测。

　　2 结果与讨论

　　2.1 菌株的分离与鉴定

　　分离得到的 3 株菌命名为 LY1，LY2，LY3 三者均能以不同微塑料聚合物作为唯一碳源生长。这一结果表明这 3 种菌株物具有降解 PE、PP 和 PS 塑料的能力。他们利用聚合物的能力可能源于他们对塑料滋生环境的适应性。

　　2.1.1 菌株的形态学观察

　　在 LB 固体培养基中，LY1 的单菌落边缘呈不规整白色干枯状圆形菌落，直径 2~3 mm;LY2 的单菌落呈黄色，表面光滑、凸起、湿润，直径 1 mm 左右，LY3 的单菌落呈橘黄色，表面光滑、凸起、湿润，直径 2~3 mm，如图 1(a),(b),(c)所示。在透射电镜下，LY1 的形态呈长杆状，LY2 的形态呈短棒状，LY3 的形态呈短杆状，如图 1(d),(e),(f)所示。

　　2.1.2 系统发育树构建

　　将 3 种菌株(LY1、LY2、LY3)的 16S rRNA 基因序列进行 BLAST 同源性比较分析，选择相似度在 99.05% 以上的 10 组同源序列制作系统发育进化树(如图 2)，经比对分析发现菌株 LY1、LY2、LY3 分别与 Bacillus sp.，Microbacterium sp.，Chryseobacterium sp.在同一分支上，亲缘关系最近。根据上述形态学观察以及进化树的对比结果，菌株 LY1、LY2、LY3 被鉴定为 Bacillus sp.，Microbacterium sp.，Chryseobacterium sp.。

　　2.2 分离菌的生物降解试验

　　在生物降解实验中，菌株的生长曲线显示，3 种菌对不同的微塑料表现出不同的代谢反应(如图 3)，且混菌均在培养基中浓度更高，生长更快，因此，接下来的实验将对 3 种菌株的混合培养物进行的生物降解特性的研究。

　　图 4 为混合菌株在 3 种微塑料为碳源的无机盐培养基中的生物降解实验经过 50 d pH 的变化。微塑料的降解显著降低了培养液的 pH，培养液的 pH 从均初始中性 7.2 变化到 6.0 左右。Gong 等 [18]认为，微生物与微塑料一起培养导致微塑料逐渐缓慢降解，改变了微塑料聚合物基体的微观结构，并分泌了酸性副产物，这导致了培养液中 pH 降低。pH 的降低证明培养物仍然具有代谢活性微生物分泌多种胞内和胞外酶到培养基中，这些酶可能对聚合物的降解起作用。在聚合物降解过程中，复杂聚合物首先被外酶分解成短链或单体，外酶小到足以渗透细胞壁，通过解聚过程用作碳和能源[19]。

　　2.3 生物降解特性

　　2.3.1 微塑料聚合物的失重分析

　　失重率的测定是测定生物降解最有效的方法[20]。50 d 的降解期结束后，微塑料的质量减轻可归因于降解菌的生物降解。将 3 种微塑料 50 d 后的失重率进行了比较，50 d 后菌株对 PE、PP 和 PS 的最大失重率为混合菌作用体系下的失重，失重率分别为 6.7%、4.3%和 8.2%，对照组(未接种降解菌)中基本无质量的变化。混合菌对微塑料质量的改变是由于混合菌共同发挥作用致使微塑料化学键断裂，导致微塑料聚合物羰基和末端双键指数增加[21]，使得菌体分泌的胞外酶能够更快的启动适应机制进行生物氧化或水解，且 PS 的失重率>PE 的失重率>PP 的失重率，这种质量损失可能是由于降解菌的基因组成，菌株可能具有相当大的聚合物降解能力，对于不同塑料降解方面存在的差异可能是代谢率和聚合物吸收机制存在差异。

　　2.3.2 微塑料聚合物的红外光谱分析(FTIR-ATR)

　　为了估计生物降解后微塑料的结构变化，分析了微塑料红外辐射吸收率;当微生物引入氧化基团时，非极性键转化为极性键，导致不稳定性增加，并为微生物定居和酶断裂提供场所[21]。3 种类型的微塑料颗粒经混合菌在无碳源培养基中培养 50 d 后，在 4 000~500 cm -1的频率范围内，通过 ATR 分析生物降解的 3 种微塑料颗粒的化学结构，如图 5 所示。图 5(a)为 PE 经不同菌株作用后的红外辐射吸收率，在 2915.3, 2846.4 , 1 466.4, 720.6cm -1处出现特征峰[22]。2 915.3, 2 846.4 cm -1处的强带分别对应于烷烃分子中脂肪族 C—H 键的不对称和对称振动，1 466.4 cm -1和 720.6 cm -1处的强峰分别是由于 C=C 键拉伸、亚甲基(—CH2)基团、芳香族(C—H)弯曲和具有 4 个碳原子的长直链烷烃键。PE 仅由碳和氢原子组成。经混合微生物作用后， PE 在 1 620.2 cm -1和 1 253.1 cm -1处均出现了新的吸收带，可能是由于形成氨基和羟基化合物，羰基带被胺基带取代表明菌株在微塑料诱导的环境中有良好的代谢，也可能是 PE 的化学结构受到逐渐干扰而导致降解的证据[23]，这些发现可能是由于菌株的作用导致 PE 氧化。图 5(b)为 PP 微塑料经不同菌株作用后官能团变化，生物降解后的 PP 微塑料在 3 416.6 cm -1处形成了一个宽而强的峰，该峰赋值于 O—H，在未接种菌株的 PP 微塑料中，1462.8 cm -1处的羰基带(C=O)较强且拉长[24]，而在接种了菌株的 PP 微塑料中，羰基带移到了 1 575.2 cm -1处;2 963.2~2 830.4 cm -1处的 C—H 脂肪族拉伸峰和 1 462.8 cm -1处的 C—H 脂肪族弯曲峰也有明显的减少;峰在 1 455 cm -1处的还原被认为是 C=C 的芳香族延伸;在 998cm -1和 973 cm -1处的吸收峰的伸长率属于 C=C 弯曲[25]。图 5(c)为 PS 微塑料经不同菌株作用后官能团变化，观察到的键振动有 2866.7~ 3 028.5 cm -1处的 C—H 键，1 491.1~1450.5cm -1处的 C=C 键[26]。在接种了混合菌株的 PS 中，可以观察到 1 248.8 cm -1处的 C—O 和 1 349.6 cm -1处的 C—H 键的酚醛谱带以及峰的缩小。不同频率下形成的氧化产物表明聚合物被微生物降解。

　　2.3.3 微塑料聚合物的 SEM 观察

　　如图 6 所示，在扫描电子显微镜下，微塑料发生了形态学变化。与混合菌培养 50d 后，微塑料表面变得粗糙，并有侵蚀、裂纹和沟槽，如图 6(d)~(f)，未接种降解菌的对照组图 6(a)~(c)表面光滑。3 种微塑料的表面变化表明，混合菌能够粘附在微塑料料聚合物表面形成菌落并造成表面损伤。在 El-Sayed 等[27]关于聚乙烯降解的研究中，SEM 分析证实了微生物在聚合物表面聚集，去除微生物后聚合物表面也发生物理坑蚀，这一结果为微塑料在微生物作用下的劣化提供了证据，并证实了微生物的降解能力[28]。利用 SEM 作为分析 工具，展示塑料表面上形成的侵蚀、空洞和孔洞，以指示定值和降解的程度。利用 SEM 评价塑料聚合物的宏观改性，如表面劣化、孔洞的形成、裂纹等变化，是一种可靠的聚合物生物降解评价方法。

　　3 结论

　　(1)将城市垃圾填埋场的垃圾渗滤液作为降解菌来源，在以微塑料作为唯一碳源的液体培养基中驯化菌株，通过划线分离等步骤得到 3 株菌经 16S rRNA 基因鉴定为 Bacillus sp.、Microbacterium sp.、 Chryseobacterium sp.，由于菌体生长浓度的增加以及微塑料的质量损失，说明从垃圾渗滤液中成功分离出对微塑料具有潜力的细菌。

　　(2)通过测定生物量、重量损失、培养液 pH、ATR-FTIR 以及 SEM 观察，探究 3 种菌分别对不同微塑料的降解特性，并验证 3 种混菌混合培养能否提高生物降解效率。实验观察到在单独菌以及混合菌 50 d 的作用下，微塑料质量均有不同程度的损失并生成了新的含氧基团，但混合菌作用下的微塑料失重率最高，说明菌株的混合培养提高了微塑料的生物降解效率。

　　(3)尽管这是一项缓慢的技术，但这表明了从周围环境中发现可降解传统类型塑料的微生物的可能性很大。今后的研究应致力于阐明塑料降解的途径并深入了解微生物酶在生物降解中的作用，将有利于开发新的塑料聚合物生物修复策略。