分析超速离心技术在蛋白质研究中的应用

　　摘 要：分析超速离心技术(analytical ultracentrifugation，AUC)是检测生物大分子溶液中生物物理性质的重要技术，利用沉降速率(sedimentation velocity, SV)和沉降平衡(sedimentation equilibrium, SE)方法，通过紫外/可见光、干涉光以及荧光检测器来记录样品池中生物大分子径向浓度分布，以获得其水力学、生物物理学特性。该文介绍了分析超速离心技术的产生与发展、测试原理与数据分析方法，列举了分析超速离心技术在蛋白质性质分析、蛋白质与生物分子间相互作用测定、蛋白质结构解析以及蛋白类生物类似药分析中的应用实例，并展望了其在蛋白质研究中的应用与发展前景。

　　李冬冬; 褚文丹; 李文奇， 实验技术与管理 发表时间：2021-07-29

　　关键词：分析超速离心技术;沉降速率;沉降平衡;蛋白质研究

　　分析超速离心技术(AUC)是通过记录生物大分子在溶液中的沉降行为来表征其生物物理学性质的一项经典技术，在生命科学、尤其是蛋白质科学研究中具有广泛应用。利用分析型超速离心机的紫外/可见光、干涉光以及荧光检测方法，进行沉降速率(SV)或沉降平衡(SE)两种模式的实验，可获得蛋白质的分子量、纯度、聚集状态以及生物分子间相互作用等信息，在蛋白质研究中发挥重要作用。目前，分析超速离心技术已成为蛋白质研究中必不可少的技术手段。

　　1 分析超速离心技术的产生及发展

　　1924 年，Svedberg 设计发明了第一台分析超速离心机，用来分析胶体的尺寸与分布情况，因此获得了 1926 年的诺贝尔化学奖[1-3]。同期，Svedberg 利用分析超速离心技术分析测定了蛋白质的沉降系数和分子量，扩展了分析超速离心技术的应用范围，开启了该技术在生物大分子领域中的应用[4-5]。1953 年，沃森与克里克提出了 DNA 的半保留复制机制猜想[6]。1957 年，Meselson 和 Stahlf 等利用分析超速离心技术分析了复制过程 DNA 的构象特征，验证了 DNA 半保留复制机制，这一经典案例被称为生物学界“最漂亮的实验”[7]。

　　1947 年，贝克曼公司生产的分析超速离心机 Model E，促进了分析超速离心技术在生物大分子方面的应用。然而，Model E 体积庞大、操作及维护非常复杂，限制了分析超速离心技术的进一步发展。直至 21 世纪初，贝克曼公司推出了新型号分析超速离心机 ProteomeLab XL-A/I。随后，Aviv Biomedical 公司开发了与分析超速离心机配套的商业化荧光检测器及软件。随着计算机数据处理能力的提高，尤其是美国国立卫生研究院 Peter Schuck 实验室对分析超速离心技术数据处理理论模型的改进，使得其在蛋白质研究中的应用得到了极大的促进和发展[8-10]。2017 年，贝克曼公司推出了最新型号的分析超速离心机 Optima AUC，数据检测稳定性更强，仪器操作也更加简便。该技术发展历程概述如图 1 所示。

　　2 分析超速离心技术的原理与方法

　　2.1 分析超速离心机的组成

　　分析超速离心机主要由动力系统和光学检测系统组成[11]。

　　动力系统包括驱动系统、真空系统、控制系统、防护系统、转子和样品池;前 4 部分与制备型超速离心机类似，但转子和样品池为分析超速离心机所特有。其中，转子的材质为钛合金，按样品个数不同分为 4 孔的 An-60Ti 和 8 孔的 An-50Ti 两种型号。样品池由中心件、蓝宝石(或石英)窗口、垫片、螺丝和外壳组成，是分析超速离心机中唯一与样品接触的部件。

　　光学检测系统有 3 种，分别为紫外/可见光吸收检测器、干涉光检测器和荧光检测器，目前应用较广泛的是前两种检测器，荧光检测器的应用正在迅速发展中[12]。

　　紫外/可见光吸收检测器与常用的紫外分光光度计原理类似，当样品在某波长内有吸收时，记录离心过程中样品在转子径向上不同位置的吸光度，完成检测。

　　干涉光检测器应用了光的干涉作用，当光透过参比液和样品时，由于二者的折射率不同导致光程变化，在收集器上等光程的点发生位移，干涉条纹位移距离与溶质浓度成正比。通过监测干涉条纹位移情况，可以获得溶质浓度在转子径向上随时间的变化。干涉光数据利用 CCD 相机进行收集，可以在瞬间完成，效率更高。

　　荧光检测器内部光学部件的组装与共聚焦显微镜的光学元件相似，通过二极管激光器发射出 488 nm 的激发光，经过一系列的光学元件，最终产生波长为 505~565 nm 的发射光到达光电倍增管(PTM)。PTM 接收到的发射光信号与样品在转子径向位置的函数关系，可以作为进一步分析处理的实验数据。与紫外/ 可见光吸收检测器、干涉光检测器相比，荧光检测器在灵敏度及样品选择范围上都得到了提高。但是，荧光检测器需要样品中荧光基团的配合，会在一定程度上干扰分析物的天然特性[3]。

　　2.2 分析超速离心技术的基本原理

　　在分析超速离心机运行时，样品池中的溶质悬浮于溶液中并在离心场作用下运动，受到的作用力分别为：离心力 Fs，浮力 Fb 和摩擦力 Ff，当 3 者达到平衡，溶质进行速度为 u 的匀速沉降运动。由力学公式： 2 2 s b A A f 0 o M M F F F r r fu N N         (1)其中，M 为溶质颗粒质量，NA 为阿伏伽德罗常数， ω为转头角速度，r 为旋转轴心至界面的径向距离， ω2 r 为离心加速度， o 为溶剂密度， p  1/  为微分比容(partial specific volume)，p 为蛋白质常数 f 为摩擦系数。

　　得到：  0 2 A u M 1 r N f   (2)定义沉降系数 s，单位为 S(Svedberg，1S=10–13s)： 2 u s  r  (3)由 Einstein-Stokes 关系： B B h 6π kT kT D f R   (4)其中，D 为扩散系数，kB 为波尔兹曼常数，T 为绝对温度， 是溶剂粘度，Rh 为流体力学半径。因此，由以上公式得到： 0 MD(1 ) s RT   (5)其中， 0 为溶剂密度， R kN  B A 为气体常数，式(5)即为 Svedberg 方程。

　　颗粒置于离心场中在离心力作用下沉降，考察样品池中与转轴距离为 r，长度为 a，厚度为 dr 的体积元(如图 2 所示)，溶质通过 A 面是沉降与扩散的综合结果。

　　可以得到在单位时间内沉降的净溶质量 ms ： d s 2 · d m c ra u c ar s r t         (6)其中， c 为距离 r 处的溶质浓度， 为有效微分比容。在单位时间内扩散的净溶质量 mD ： D d d m c D ar t r      (7)因此，单位时间内体积元的溶质改变量为： d 2 d m c ar cs r D t r           (8)另一方面，体积元内溶质随时间的变化为： d /d d 1 d d c mV m t t t ar r      (9)代入上式即得到 Lamm 方程： c c 1 2 D s rr trr r              (10)当 s 和 D 不随溶质浓度发生变化，式(10)可写作 2 2 2 1 2 c cc c D r cs t rr r r                   (11)通过 Lamm 方程可以认识到，溶质浓度随时间和距离的变化由沉降和扩散两方面决定。在沉降速率实验中，解式(11)就可以获得 s 和 D，再与 Svedberg 方程结合，可以得到溶质的分子量 M。在沉降平衡实验中，溶液中溶质浓度不再随时间发生变化，式(10)等式为 0，方程有精确解，可以获得精确度较高的分子量 M[8-10,13]。

　　2.3 分析超速离心技术的实验方法与数据处理

　　分析超速离心技术两种经典的实验方法分别是沉降速率法和沉降平衡法。

　　沉降速率实验是在较大的离心力作用下，样品在较短时间内全部沉降到样品池底部，在不同时刻收集的数据可以反映该时刻在不同径向位置的溶质浓度，通过解析 Lamm 方程和 Svedberg 方程可以得到沉降系数 s、扩散系数 D 和分子量 M 等信息[14]。沉降平衡实验是在较低的转速下，不同浓度的样品分别在不同转速下达到沉降与扩散的平衡，对沉降平衡数据进行整体分析(global analysis)后得到分子量等信息[15]。

　　近年来，随着计算机技术的发展和数据处理模型的应用，分析超速离心数据处理程序越来越多，如： DCDT、Ultrascan、SEDFIT/SEDPHAT 等。本实验室选择的是由美国国立卫生研究院的 Peter Schuck 等研发的 SEDFIT/SEDPHAT 软件，由于其高可靠性、易操作和高效率，已成为目前应用最为广泛的分析软件之一[16-17]。SEDFIT 主要用于沉降速率实验数据的分析，本实验室常用的是 Continuous c(s)Distribution Model，它利用 Lamm 方程模拟沉降边界，代入方程进行求解，然后利用最小二乘法将全部数据进行优化拟合，从而得到溶质的具体信息。通过 c(s)即沉降系数分布模型计算结果可以得到各组分的分布比例、沉降系数以及拟合分子量等信息[18]。SEDPHAT 软件主要用来分析沉降平衡实验数据，当样品沉降过程中达到平衡状态时，根据 Lamm 方程可以得到更精确的分子量 M 值， SEDPHAT 软件可以同时拟合多个浓度多个转速的实验数据，得到误差率小于 2%的绝对分子量，此条件下要求实验样品足够均一。SEDPHAT 软件还可以用来分析蛋白质自聚集和相互作用实验数据，计算解离常数。

　　3 分析超速离心技术在蛋白质研究中的应用

　　蛋白质是由氨基酸组成的有机大分子，作为生命活动的主要执行者，在基因表达调控、信号传导以及疾病的预防与治疗等方面发挥了重要作用。近年来，蛋白质科学研究发展迅速，新的蛋白质研究技术也不断涌现。目前有多种方法可以对蛋白质性质和相互作用进行研究，如紫外、荧光、红外等光谱仪可以分析蛋白质光学特性;琼脂糖凝胶、高效液相色谱和质谱技术可以分析蛋白质分子质量;圆二色光谱仪可以分析蛋白质二级结构、三级结构;X-射线晶体学、冷冻电镜以及核磁等技术可以分析蛋白质空间结构;表面等离子体共振技术(surface plasmon resonance, SPR)、等温滴定微量热技术(isothermal titration calorimetry, ITC)、微量热泳动技术(microscale thermophoresis, MST)等可以检测蛋白质间的相互作用。随着分析超速离心技术的发展，其在蛋白质研究中的应用也更加广泛，优势也更加突出。从蛋白质均一性、分子量的测定，到蛋白质构象变化，再到蛋白质相互作用、结合比例的测定以及蛋白类生物类似药的质量评价，分析超速离心技术在蛋白质性质分析方面发挥越来越重要的作用。

　　本文统计了近 30 年来分析超速离心技术相关的科研文献，结果表明文章发表数量呈明显上升趋势。此外，统计数据表明蛋白质研究是分析超速离心技术应用的主要方面，2019 年发表的分析超速离心技术相关文章中，蛋白质研究占比 77%，远高于分析超速离心技术在其他方面的应用，如图 3 所示。本文主要介绍分析超速离心技术在蛋白质研究中不同方面的应用。

　　3.1 可溶性蛋白质性质的测定

　　可溶性蛋白质是指可以溶于水溶液的蛋白质，在水溶液中以分散态存在。分析超速离心技术对可溶性蛋白质的检测分析，可以获得多项表征蛋白质理化性质的信息，如沉降系数、分子量、摩擦系数以及轴长比等。

　　本实验室利用分析超速离心技术研究了拟南芥 SnRK2.6(sucrose non-fermenting1-related protein kinase 2.6)末端多聚酸性氨基酸序列对蛋白溶液性质的影响，并将多聚酸性氨基酸序列连接至拟南芥 PYL10 (PYR like protein 10)分子末端进行分析。通过 AUC 方法确认 SnRK2.6 蛋白在溶液中以单体形式存在，多聚酸性氨基酸序列会引起分子轴长比增加，水合半径增大，分子排阻层析洗脱体积明显变小，因此利用分子排阻层析法判断蛋白质分子在溶液中的聚合状态，需要非常谨慎[19]。

　　3.2 膜蛋白性质的测定

　　膜蛋白是生物功能的重要承担者，在细胞间接触、表面识别、信号传导、酶活性和运输等方面扮演着重要角色。在膜蛋白的纯化过程中通常需要添加去垢剂来促进膜蛋白的溶解，而不同种类的去垢剂及其用量会对膜蛋白的理化性质、聚集状态产生不同影响。分析超速离心技术可以测定膜蛋白-去垢剂复合物在离心过程中的沉淀行为，分析获得其水力学参数，判断膜蛋白在不同去垢剂中的均一性及聚集状态。

　　γ-分泌酶是由 4 个亚单位组成的膜内蛋白水解酶，参与 β-淀粉样前体蛋白的水解过程，在阿尔兹海默症发病中扮演了重要角色。周瑞等使用分析超速离心技术对功能缺失的 γ-分泌酶突变体进行分析，发现 γ-分泌酶突变体在洋地黄皂苷(digitonin)、丙磺酸盐(CHAPSO)去垢剂中具有不同的形态，在 digitonin 中是单体的状态，而在 CHAPSO 中呈现寡聚的状态[20]。

　　本实验室发表的相关文章也阐述了分析超速离心技术在研究膜蛋白性质中的应用，文章以嗜热菌来源的 ATP 结合转运蛋白(ABC transporter)TmrAB 作为研究对象，利用 AUC 技术，研究其均一性、聚合状态以及去垢剂与膜蛋白的摩尔比等性质。研究得到在去垢剂 DDM 浓度为 8 倍 CMC 条件下，TmrAB 以异二聚体的单体形式存在，状态均一，DDM 与 TmrAB 的摩尔比为 116∶1，证明分析超速离心技术是一种测定膜蛋白分子量、研究膜蛋白聚合状态的可靠手段[21]。

　　3.3 蛋白质自聚集分析

　　蛋白质自聚集是广泛存在的一种蛋白质自相互作用现象，是生命活动中重要的调节机制。因其单组分的特性，导致蛋白质自聚集亲和力分析具有一定的难度，如常见的 SPR、ITC、MST 等方法都只能用来测定不同蛋白质之间的相互作用。分析超速离心技术是为数不多的可以用来测定自聚集亲和力的方法。SE 方法可以通过不同聚合模型的拟合来分析结合解离常数，适合分析样品的动态聚集;SV 方法可以对不同浓度下实验样品的沉降系数分布进行整体分析，获得样品结合解离信息，测定从 pM 到 mM 的亲和力[22-23]。

　　早在 20 世纪 30 年代，Shire 等就开始运用 SV 的方法分析不同浓度下蛋白质的聚集状态[24]。在对 gp57A 自聚集现象的研究中，研究者也是利用 SV 方法最终确定了 gp75A 的聚合方式[25]。

　　本实验室与美国国立卫生研究院 Peter Schuck 团队合作开展的最新研究，以常见商用蛋白 β-lactoglobulin 的同型二聚作为模型，准确测定了其自聚集平衡结合常数，为蛋白质自聚集研究提供了一种完整的实验技术方法。文章详细介绍了蛋白质自聚集实验中仪器校准、沉降速率设计、数据分析、结果统计评估等步骤，建立了一套应用分析超速离心技术研究蛋白质自聚集的标准方案，对 AUC-SV 方法在自聚集方面的应用提供了有效指导[26]。Yang 等利用上述方法研究了嗜乳脂蛋白 BTN3A1 的自聚集情况，其二聚体解离成单体的解离常数为 1.1 mM[27]。

　　随着荧光检测系统(fluorescence optical detection system，FDS)的应用开发，分析超速离心设备检测灵敏度大大提升，FDS-SV 方法可以分析更高亲和力的自聚集现象。Zhao 等利用谷氨酸受体 GluA2 氨基末端结构域作为高亲和力同源二聚的模型，研究了荧光标记的选择对自聚集结合常数的影响。结果表明， Dylight488 标记的 GluA2 和 EGFP 融合蛋白表达的 GluA2，解离常数与天然 GluA2 一致，分别为 20.5 nM 和 25.4 nM，而 FAM(5,6-羧荧光素)标记的 GluA2 解离常数约为 2.3 nM。此研究一方面说明 FDS-SV 可以进行 nM 级高亲和力的测定，另一方面也提示应用 FDS-SV 需要选择合适的标记方法才能得到更为准确的实验结果[28]。

　　3.4 蛋白质与生物分子间相互作用的测定

　　蛋白质与生物分子间相互作用在信号通路、转录调控以及其他生命过程中发挥关键作用[29]。近年来，蛋白质与生物分子间相互作用方面的研究发展迅速，许多传统和新兴技术运用到分子相互作用的测定中[30]。分析超速离心技术的两种实验方法 SV 和 SE 均可应用在蛋白质与生物分子间相互作用的研究中。

　　SV 是通过样品在不同浓度下得到的沉降系数分布对结果进行分析，随着样品浓度的变化沉降系数出现明显偏移，说明在沉降过程中有相互作用发生。另外，SV 还可以完成多种信号的同时采集(multi-signal SV，MSSV)，对复合物的检测分析更加完整。MSSV 可以通过混合物中不同组分的光谱特征去研究其各自的沉降系数分布，然后再进行整体分析，得出各个组分在混合物中的比例。与 SV 相比，SE 在蛋白质与生物分子相互作用研究中的应用时间更久，其明显优势在于可以同时记录不同浓度、不同转速下的样品平衡情况，进行整体分析，得到更准确的测试结果[31]。

　　3.4.1 蛋白质间相互作用的测定

　　蛋白质间相互作用对细胞周期调控及信号传导具有重要意义。分析超速离心技术的 SV 实验可以分别将单独的蛋白和蛋白复合物进行相同条件下的离心沉降，根据沉降系数、分子量的变化，判断相互作用是否发生，调整复合物中不同蛋白质的比例，还可以获得相互作用的化学计量比和解离常数。SE 实验可以在不同样品浓度、不同的转速条件下检测蛋白复合物的沉降平衡状态，进而分析获得蛋白相互作用的解离常数。EisemannT 等在对端锚聚合酶的研究中，通过 SV 和 SE 实验，结合 ITC 检测结果，证明了 TNKS(human tankyrase-1)和 GMD(GDP-mannose 4,6- dehydratase)是以 1∶1 比例结合，为蛋白复合物晶体样品制备提供了重要参考信息[32]。Brown 等在 2008 年发表的方法学文章详细描述了 SV 方法测定蛋白相互作用的基本原理、实验内容、数据处理等具体信息[33]。Zhao 等正是利用该方法结合荧光检测系统，成功测定了 20.5 pM 的抗体与 FGFP 亲和力，进一步提高了 SV 方法在亲和力方面的检测范围[34]。

　　3.4.2 蛋白质与核酸相互作用的测定

　　蛋白质与核酸的相互作用存在于生物体的多个生命过程中，如 DNA 的复制、修复、转录、翻译以及反转录等，分析超速离心技术也可以用于蛋白质与核酸相互作用的研究。Philo 等在研究鸡卵溶菌酶与 DNA/RNA 配体的相互作用中，应用 AUC-SV 方法，结合荧光偏振和 ITC 技术进行分析，证明了此相互作用具有静电特征，盐浓度和温度的变化都会引起亲和力改变[35]。Ortega 等同时运用分析超速离心技术的 SV 和 SE 两种方法研究表明，在无光照情况下 AdoB12 可以诱导 TtCarH 形成四聚体，四聚体 TtCarH 可以结合 DNA[36-37]。

　　3.4.3 小分子诱导蛋白质间相互作用的测定

　　小分子通常是指分子量小于 1 000 Da 的分子，如多肽、植物激素、金属离子、药物分子等。小分子通过诱导蛋白质间相互作用参与多种生命活动，如植物激素调节、信号传导等。植物磺肽素(phytosulfokine， PSK)是一种含两个酪氨酸磺化修饰的五肽激素，在植物体中作为信号分子调节植物的生长发育。王继纵等于 2015 年在对植物磺肽素的研究中，通过 SV 实验分别检测了存在或缺失 PSK 的情况下，体细胞胚胎是否发生受体样激酶( SERK ) 和 PSK 受体激酶 (PSKRLRR)异二聚化沉降行为，结果表明 PSK 可以诱导 PSKR 与 SERK 发生异源二聚[38]。

　　3.5 蛋白质结构解析的应用

　　在结构生物学研究中，蛋白质样品的准备过程影响着样品的质量，如蛋白质的聚集状态、均一性、单分散程度等，进而影响小角散射、X 射线衍射、核磁共振或冷冻电镜等结构生物学方法的实验测定结果。利用分析超速离心技术，可以协助判断不同条件下蛋白质样品的质量，有助于节省后续实验时间和成本。

　　另外，分析超速离心技术还可以与小角散射(SAS)技术联用，帮助解析蛋白质结构。用于 SAS 的样品通常是高度纯化和单分散的，但也存在轻微的聚集扰乱数据质量，去除聚集物的影响是 SAS 技术面临的重大挑战。分析超速离心技术可以获得溶液中各组分浓度的分布信息，将多组分溶液的 SAS 信号强度进行分解。Morishima 等在最新的研究中采取 AUC-SAS 联用方法，成功分析了含有高聚体的溶液中特定单体的 SAS信号强度以及弱相互作用体系中复合物的 SAS信号强度，有利于后续的蛋白结构解析过程[39]。

　　3.6 蛋白质构象变化分析

　　蛋白质构象变化在生物信号传导中发挥重要作用。Kreiner 等利用分析超速离心对 FIII9′-10 进行分析发现，不同构象的 FIII9′-10 蛋白的沉降系数存在明显差异，说明分析超速离心方法是测定蛋白构象变化的有效手段[40]。

　　在最新发表的文章中，Brautigam 等利用分析超速离心技术，以牛血清蛋白(BSA)和突变的葡萄糖结合蛋白(TpMglB-2WA)为研究对象，验证了沉降速率法和差异沉降速率法( difference sedimentation velocity，DSV)可以有效地检测蛋白质构象变化[41]。结果表明，4%重水可以引起 BSA 构象变化;D-葡萄糖可以诱导 TpMglB-2WA 蛋白的构象变化，与晶体结构数据一致[42]。Brautigam 等同时开发了免费专业软件 DiSECT，用于处理 DSV 实验数据，可以有效地降低噪音信息，获得微小的沉降系数差，进一步提升了数据处理与分析能力。此成果将有效推动分析超速离心技术在检测蛋白质构象变化方面的应用。

　　3.7 蛋白质药物的应用

　　近年来，蛋白质药物发展迅速，在一些疾病治疗方面显示出明显优势。蛋白质药物聚集体会引起患者的不良免疫反应，蛋白质药物的聚集状态是影响药物质量的关键指标。分析超速离心技术可以在溶液状态下对蛋白质药物制品进行直接测定，得到更加精准的实验结果，被越来越多地应用在医药研发中。

　　凝血因子Ⅷ(fVIII)是治疗 A 型血友病的有效药物，重组 fVIII 蛋白往往具有一定的免疫原性，被次氯酸盐氧化后的重组 fVIII 免疫原性增强。为了研究氧化诱导的免疫原性和分子聚集之间的潜在联系， Zakas 等通过分析超速离心技术对氧化前后的重组 fVIII 产品 Helixate 进行分析，结果表明氧化诱导的免疫原性不用于聚集介导的免疫反应，为 fVIII 免疫原性机制的多样性研究提供了有力证明[43]。

　　随着原研蛋白类生物药专利到期，蛋白类生物类似药研发成为医药研发的重要方向。在蛋白类生物类似药申报中，聚集体的检测作为一项重要指标，在进行蛋白类生物类似药一致性评价时非常关键。FDA 在蛋白类生物类似药指导原则中提出须使用多种分析方法来评估同一性质，建议使用分析型超速离心技术(AUC)与尺寸排阻色谱(SEC)等方法共同检测分析药物聚集体，但 SEC 通常无法检出非共价结合的低聚物。AUC 技术检测样品不需要标准品和标记物，也不需要与基质相互作用，检测器的高灵敏度使得检测结果更精准，已成为 FDA 检测蛋白药物非共价聚集的“金标准”。

　　4 展望

　　基于扎实的热力学和流体力学理论，分析超速离心技术在蛋白质研究中得到越来越广泛的应用，但也存在一定的局限性。分析超速离心技术要求被检测样品纯度高、浓度适宜，对于细胞裂解液、血浆、尿液等含有高浓度、复杂成分的样品无法直接测量。在检测生物分子间相互作用的应用中，与 ITC、SPR、MST 等技术相比，分析超速离心技术所需测试时间较长(从 SV 实验的几小时到 SE 实验的几十小时)，因此对蛋白质稳定性要求较高。

　　随着荧光检测器的发展和数据处理软件的优化，有望实现对高浓度样品或复杂成分样品的有效检测。目前已有部分应用案例如对高浓度的单克隆抗体以及模拟的人血浆样品的测试分析[44]。分析超速离心机还可以进一步整合其他检测手段，如光散射检测法，扩展分析超速离心技术的应用范围。此外，目前的分析超速离心数据处理软件操作繁杂，进一步优化数据处理过程，也是未来的发展方向之一。