东方百合ANS基因的克隆与对拟南芥过表达的表型分析

　　摘 要 ANS 为花青素植物花青素合成途径末端的关键酶基因，通过东方百合材料克隆获得 3 个 ANS 同源基因，解析碱基水平和氨基酸水平上的差异对基因转录水平及表型影响，深入研究百合 ANS 的功能特性，进一步完善百合花色形成的分子机理奠定理论基础。选取东方百合‘西伯利亚’品种为材料，通过同源克隆技术鉴定了 LsANS1、LsANS2、LsANS3，分别构建其过表达载体，花序侵染法转化拟南芥，经潮霉素抗性筛选及分子检测获得阳性植株。利用电子解剖镜观察和 qRT-PCR 定量分析表达量差异，验证野生型与转基因植株后代的表型差异。LsANS1 与 LsANS3 高度同源，转基因阳性植株主茎上分布明显红色，可能是由于 DIOX_N (non-haem dioxygenase in morphine synthesis N-terminal, 吗啡合成 N-端的非血红素加氧酶)亚家族结构域上的个别碱基的变异导致基因表达水平而发生了表型差异;LsANS2 与其他两个同源基因存在氨基酸序列上的差异，基因表达水平上远远低于其他两个同源基因，表型上出现略微淡红色。

　　本文源自杨成龙; 张洁; 方少忠; 郑益平; 林智敏， 分子植物育种 发表时间：2021-06-17

　　关键词 百合; ANS; 花青素; 功能分析

　　花青素是一种重要的植物水溶性色素，在结构上属于类黄酮化合物，是植物器官显色的主要色素(张彬等 , 2014; 顾林等 , 2007) 。 无 色 花 青 素 双 加 氧 酶 / 花 青 素 合 成 酶 (Leucoanthocyanidin Dioxygenase/Anthocyanidin synthase, LDOX/ANS)位于花青素生物合成途径末端，作用于花青素生物合成的倒数第二个步骤，其产物是花色素生物合成途径的第一个显色化合物，能够使无色花色素转换有色花色素的(Liu et al., 2010; Nakajima et al., 2001; 亓希武等, 2013)。ANS 基因首次分离是在紫苏(Saito et al., 1999)上实现，后续在山药(周生茂等, 2009)、金荞麦(卜星星等, 2014)、芥蓝(赵蓉蓉等, 2010)、桑树(亓希武等, 2013)、芜菁(许志茹等, 2009)等多种植物中都分离出了 ANS 基因。

　　百合(Lilium brownii var. viridulum Baker)是百合科百合属球根花卉，因其观赏价值而成为著名的切花品种、园林植物和盆栽植物(Theissen, 2001)。由于花色是观赏植物的重要形状之一，影响着观赏作物的商业价值(Burchi et al., 2010; Kelley et al., 2001)，因此在百合的育种研究上，尤其是分子育种方向，对于花色素方面的研究工作成为热门领域。近年来，百合花青素相关基因的研究工作取得了较大的进展，但主要的深入研究都集中在 CHS，如 LCH2 (杨丽等, 2006)以及 CHS 启动子在转基因植株中能驱动外源基因的表达(常小丽, 2008)，花青素合成酶的研究则主要集中在 bHLH 与 MYB 转录因子的对应调控(Yamagishi et al., 2010; Koes et al., 2005)。然而，对下游结构基因的调控对百合花色素合成的影响机制目前仍知之甚少。

　　此外，过量表达 ANS 基因增加转基因植株花青素的含量在多个物种上都已经被验证可行(亓希武等, 2013)、(孙海燕, 2015)、(Reddy et al., 2007)，但 ANS 的表达受多种因素影响，其中自身序列编码区核苷酸插入与缺失也会影响基因表达(Ben et al., 2015; Nakatsuka., 2012)。根据前人对 ANS 基因的研究基础，为进一步探究基因表达是否会受基因编码区的 SNP 位点以及编码区核苷酸插入与缺失影响，本研究在百合 ANS 的功能研究上选取东方百合‘Siberia’品种，分离 3 个 ANS 同源基因，分别构建过表达载体，转化拟南芥进行表型观察，同时结合结构域的碱基差异、氨基酸差异与基因转录水平高低及表型差异进行对应研究，旨在进一步深入解析 ANS 基因的表达特性，探讨不同碱基位点的差异对百合 ANS 的转录水平与花色素合成的影响，为完善百合花色素形成的分子机理提供一定的理论基础。

　　1 结果与分析

　　1.1 基因克隆及序列分析

　　由于东方百合栽培种‘西伯利亚’为高度杂合品种，经同源克隆后分离得到 3 个 ANS 基因，分别命名为 LsANS1、LsANS2、LsANS3，全长序列分别为 1 080、1 026、1 080 bp。碱基比对结果表明，LsANS1 与 LsANS3 同源性更高，仅在第 186 个碱基、第 195 个碱基与第 243 个碱基存在差异。差异碱基所在区域为 DIOX_N (non-haem dioxygenase in morphine synthesis N-terminal, 吗啡合成 N-端的非血红素加氧酶)亚家族结构域 (O'Shaughnessy et al,1999)。而经氨基酸序列比对(图 1)，LsANS1 与 LsANS3 在氨基酸序列上并无差异，而 LsANS2 在第 8 个氨基酸与第 346、347 个氨基酸与其他两个同源基因存在差异，该差异不在蛋白结构域中。

　　1.2 过表达转基因植株的阳性筛选

　　通过潮霉素对 T1 代拟南芥种子进行抗性筛选，获取阳性克隆，同时 PCR 检测潮霉素抗性基因(Hyg)，结果显示抗性植株含有目的条带，大小约 875 bp (图 2)。

　　1.3 过表达转基因植株后代的表型分析

　　拟南芥的阳性纯合植株通过电子解剖镜观察表型发现(图 3)，相较于野生型，转基因拟南芥在幼苗期出现明显的表型，过量表达 LsANS1 与 LsANS3 的转基因植株在主茎处出现明显的红色，而过量表达 LsANS2 的转基因植株体则出现略微的红色。结果表明，在拟南芥幼苗期，相较于过量表达 LsANS2,过量表达 LsANS1 与 LsANS3 能明显促进转基因拟南芥花青素含量增加。

　　1.4 过表达转基因植株 LsANS 的相对定量分析

　　以百合 ACTIN 基因作为内参基因，对野生型(WT)、LsANS1、LsANS2、LsANS3 的基因表达水平进行定量分析。结果表明(图 4)，与野生型植株相比，LsANS3 表达量最高，达 708.36 倍，其次是 LsANS1，达 413.85 倍，LsANS2 表达量介于于其他两个同源基因之间，表达量相对较低，达 95.04 倍。

　　2 讨论

　　花青素合成酶作为花色素合成途径末端的酶，对花和果实的着色起着关键作用，前人在多个物种中 的研究表明 ANS 基因是花青素生物合成的重要结构基因(李霞等, 2014)。本研究选择东方百合栽培种‘西伯利亚’为材料，分离得到 3 个 ANS 同源基因，分别构建过表达载体转化拟南芥植株进行表型观察，实验结果显示过表达 ANS 主要在转基因拟南芥幼苗期出现明显表型，转基因拟南芥在主茎处出现红色着色现象，该现象与亓希武等(2013)过表达杨树 ANS 基因转化拟南芥后出现的表型变化一致，进一步验证了过量表达 ANS 基因能够促进植株花青素的积累。在转基因植株表型改变上，不同的转基因拟南芥间也存在着差异， 过表达 LsANS1、LsANS3 的拟南芥幼苗主茎上出现较为明显的红色，而过表达 LsANS2 的转基因拟南芥幼苗则红色着色情况不明显;基因表达定量分析表明，LsANS1 和 LsANS3 表达量远高于 LsANS2。本研究同时对 LsANS1、LsANS2、LsANS3 基因全长进行碱基序列和氨基酸序列进行比对，差异分析发现 LsANS1 与 LsANS3 同源性好于 LsANS2，LsAN2 第 8 个氨基酸与第 346、347 个氨基酸与其他两个同源基因存在差异，氨基酸序列的改变导致在转基因植株表型上出现不同的表型结果，LsAN3 与 LsANS1 在 DIOX_N (non-haem dioxygenase in morphine synthesis N-terminal, 吗啡合成 N-端的非血红素加氧酶)亚家族结构域上存在个别碱基的差异，即使不改变氨基酸序列，也引起了基因表达水平的差异变化。

　　通过转基因技术过量表达 ANS 基因增加花青素含量对培育丰富色彩的园艺植物和选育富含花青素的优良农作物品种具有重要意义，作物育种中，Reddy 等(2007)在水稻过量表达 ANS 基因，获取了种皮呈紫红色的转基因水稻。本文通过对百合 ANS 基因型与表型的对应关系，将为培育丰富花色的百合品种提供了一定的理论基础。

　　另外，研究表明 ANS 基因的表达存在时期特异性，在烟草(Lim et al., 2013)、草莓(Bae, 2008)、田薯(陈跃华等, 2015)、杜鹃花(Nakatsuka et al., 2008)等多个物种上均有报道。研究转基因植物仅在幼苗期出现表型变化，而在花色的着色上并未发现有明显的差异，该结果与孙海燕(孙海燕, 2015)的研究结论一致，由于可见，在花色形成的机理过程中，ANS 基因并非花色性状的主效基因，然而 ANS 基因能够催化无色花色素向有色花色素转变从而改变植株颜色，是花青素合成途径的关键酶基因，本研究的结果也揭示了过表达单一 ANS 基因不足以引起植株花色的改变却能改变植株体苗期的色素累积，说明 ANS 基因在色素形成的过程中起到了关键作用，本研究将进一步为百合 ANS 基因的改良利用提供了可靠的改良位点，同时为百合花色形成的分子机理奠定了一定的理论基础。因此，在后续对百合花色的分子改良中，可结合 ANS 基因与其他花青素合成途径的结构基因和转录因子共同调控来实现百合花色的改良。

　　3 材料与方法

　　3.1 试验材料

　　东方百合‘西伯利亚’来源南平市延欣园艺科技有限公司保存，植物总 RNA 提取试剂盒、凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、大肠杆菌 DH5a 感受态细胞购自厦门泰京生物技术有限公司。引物由福州白鲸生物科技有限公司合成。拟南芥种子、农杆菌 LBA4404、中间载体 pGXT 和 pCXUN 过表达载体质粒由实验室保存。

　　3.2 LsANS 基因克隆

　　利用 RNAprepure 多糖多酚植物总 RNA 提取试剂盒提取百合花瓣总 RNA，反转录成 cDNA。用引物(表 1)分别扩增 LsANS 序列，回收目的基因片段。连接 pGXT 载体，转化大肠杆菌 DH5a，提取质粒 DNA，经酶切验证，将阳性质粒送福州铂尚生物科技有限公司完成测序。

　　3.3 过表达载体构建及农杆菌

　　利用 XcmI 酶切 PCXUN 载体，回收大片段;PCR 扩增质粒 pGXT-LsANS，回收小片段 LsANS。采用 T4 连接酶连接过夜后转化大肠杆菌，经筛选获得重组质粒 pGXUN-LsANS。采用电击法转化农杆菌 LBA4404。挑取农杆菌单克隆提取质粒，并进行 PCR 验证。挑选阳性克隆摇菌，-80 ℃冰箱甘油保存，用于拟南芥侵染备用。

　　3.4 拟南芥种植及侵染

　　播种前将拟南芥种子放置于 4 ℃冰箱春化 3 d，将营养土装盆播种拟南芥，待其抽薹开花后进行花序侵染。将冷冻保存的农杆菌菌液活化培养后用于侵染拟南芥。活化后的农杆菌菌液加入 15 μL 表面活化剂 Silwet-77，震荡混匀，利用 Floradip 法侵染拟南芥，剪去已经开过的拟南芥的花与籽粒荚，留下花蕾备用。将拟南芥花器浸入农杆菌悬浮液 30 s 并套袋处理，重复侵染 2~3 次。收集成熟种子(T1 代)后放置 37 ℃烘干，之后置于 4 ℃保存。

　　3.5 转基因植株体的阳性筛选及表型观察

　　将存于 4 ℃的 T1 代种子取出后用 75%乙醇消毒 10 min，无菌水过滤 3 次，转移至含潮霉素的筛选培养基。待拟南芥小苗长出 4 片真叶时进行移栽。待移栽盆中培养 7 d 后，利用 DNA 提取试剂盒进行叶片 DNA 基因组提取，经 PCR 扩增潮霉素抗性基因 Hyg 及目的基因 LsANS 检测阳性植株，对阳性植株进行单株收种(T2 代)，其余后代按同样方式进行筛选种植，观察各代植株的植株体显色情况，直到收获纯合植株。

　　3.6 过表达拟南芥植株 LsANS 基因的荧光定量 PCR

　　根据百合已登录序列设计特异性引物(表 1)，由福州铂尚生物科技有限公司合成。应用 Applied Biosystems® QuantStudio®荧光定量 PCR 仪进行荧光检测，反应体系为：2× ChamQ SYBR qPCR Master Mix 5 μL，各样品的 cDNA 2 μL，Forward Primer 和 Reverse Primer (浓度 10 μmol/L)各 0.4 μL，用 ddH2O 补足体积至 20 μL。qRT-PCR 的反应程序为：95 ℃ 2 min;95 ℃ 15 s;60 ℃ 30 s，40 个循环。试验设计 3 个重复，数据读取由仪器自动完成，通过溶解曲线分析确定扩增产物的特异性。以 ACTIN 为内参基因，采用采用 2 -ΔΔCT法(Livak and Schmittgen, 2001)进行数据的相对定量分析。