PQQ诱导水稻对纹枯病的抗性研究

　　摘　要：为筛选出诱导水稻对纹枯病抗性的最佳诱导因子及其诱导最佳条件，在水稻苗期分别喷施不同浓度苯并噻二唑(BTH)、壳寡糖(COS)、吡咯喹啉醌(PQQ)、前胡提取液、益农和翆倍加，开展不同诱导因子及诱导方式对水稻纹枯病抗性影响研究。通过调查发病度，计算病情指数和相对防效，筛选出最佳诱导因子及其诱导条件(浓度、方式、诱导时间)。结果表明，BTH、COS、PQQ、前胡提取液、益农和翆倍加均能减轻纹枯病的发生，其中以浓度为 2.0 μmol/L 的 PQQ 处理防治效果最好，相对防效达到 51.0%，远高于其他诱导因子的相对防效，也显著优于对照井冈霉素。PQQ 诱导作用的最优条件为苗期喷施、浓度 2.0 μmol/L、诱导时间 72 h，其相对防效可达 50% 以上。

　　本文源自欧阳茹; 李巳夫; 鲁湘; 刘洋; 欧阳翔; 张玉烛， 杂交水稻 发表时间：2021-05-27《杂交水稻》杂志，于1986年经国家新闻出版总署批准正式创刊，CN:43-1137/S，本刊在国内外有广泛的覆盖面，题材新颖，信息量大、时效性强的特点，其中主要栏目有：、新组合、简讯 、国外动态等。

　　关键词：吡咯喹啉醌;水稻纹枯病;诱导抗病性

　　纹枯病是世界性的水稻病害，平均每年造成水稻减产 10% ～ 20%，严重时减产高达 45%[1]。该病在中国各稻区均有分布，特别是长江以南稻区发病严重 [2]。近年来，过量施用氮肥、矮秆密植的高产栽培模式导致水稻纹枯病的危害愈发严重 [3]。目前生产中缺少免疫和高抗纹枯病水稻品种，对于纹枯病的防治以化学药剂为主 [4]，但长时间使用易导致病原菌产生抗药性，迫使化学药剂用量不断增加，对农业生态环境造成严重污染。因此，迫切需要低污染高防效的纹枯病防治新方法，以保证水稻的稳产高产和环境安全。植物经过与病原体的长期协同进化，会激发一系列的防卫机制抵御病原体的侵害，植物在未受胁迫时防卫机制不会启动，而在物理、化学和生物等诱导因子的作用下，植物自身的防卫机制被激发，进而增强对病害的抗性，这种方法叫做植物诱导抗病性 [5]。通过利用植物本身的抗性机制来防治病害，是一种经济有效且对环境安全的防治措施，可能有效解决目前防治水稻纹枯病的困境。

　　植物诱导抗病性现已应用于植物病害防治，许多诱导因子被证实能够诱导植物抗病性，如水杨酸(SA)、乙烯、茉莉酸(JA)、脱落酸(ABA)、硅(Si)、前胡提取液、二氯环丙烷、2,6- 二氯异烟酸(INA)、草酸、磷酸盐、苯并噻二唑(BTH)、壳寡糖(COS)、褪黑素(MT)和茉莉酸甲酯(MeJA)等 [6-8]。其中前胡提取液被证实能有效提高水稻抗瘟性 [9]，MT 对小豆抗锈病诱导防效达 61.05%[10]，SA、INA、BTH 均可以诱导小麦产生对叶锈病、白粉病、赤霉病等多种病害的广谱抗性 [11]，ABA 溶液处理水稻的种子与幼苗可以显著提高水稻对立枯病的抗病性 [12]。诱导因子硅、乙烯、JA、BTH、COS 均能够诱导水稻对纹枯病抗性，有效减少水稻纹枯病的发生。硅能够提高水稻对稻瘟病、稻曲病、纹枯病、白叶枯病等多种病害的抵抗力 [13]，而 BTH 是第 1 个成功商品化的诱导剂，也是最早应用于水稻纹枯病防治的诱导剂 [14]。白春微研究表明 0.75 mmol/L 的 BTH 和 50 μg/mL 的 COS 均能诱导水稻对纹枯病抗性 [15]。钟庆燕研究则认为 0.2 mmol/L 的乙烯和 0.1 mmol/L 的 JA 处理对水稻纹枯病具有明显诱导抗性 [16]。目前多种植物诱导剂已经商品化，如阿泰灵、碧护、烟望素和抗病丰等。植物诱导抗病性具有抗性稳定、持久、环保等优点 [17]，在植物病害防治方面具有重大应用和潜在价值。

　　虽然多种诱导因子均能诱导水稻对纹枯病抗性，但诱导效果存在差异。本文以易感纹枯病水稻品种 Lemont 为研究对象，在水稻 3 叶 1 心期分别喷施不同浓度诱导因子，接种纹枯病后调查病情指数和相对防效，筛选出最佳的诱导因子。在最佳诱导因子处理下，分别采用浸种、浸根、喷施 3 种诱导方式处理水稻，不同时间诱导处理水稻，以确定最佳诱导因子的最佳诱导条件(浓度、方式、诱导时间)，以期为植物诱导抗病的田间应用及水稻纹枯病抗性诱导机理提供一定理论及技术支撑，为绿色高效防治水稻纹枯病提供新思路。

　　1　材料与方法

　　1.1　材料

　　供试水稻品种：Lemont。供试纹枯病菌菌株： C30 菌种，由湖南省水稻研究所李小湘研究员提供。供试药剂：苯并噻二唑(简称 BTH)化学纯 CP(98%)，由阿拉丁试剂(上海)有限公司生产;壳寡糖(简称 COS)分析纯 AR，由东京化成工业株式会社生产;吡咯喹啉醌(简称 PQQ)，由上海医学生命科学研究中心提供;前胡提取液，由湖南农业大学植物保护学院罗坤老师提供;益农、翆倍加，由湖南省农科院植物保护研究所光合细菌课题组提供。

　　1.2　方法

　　1.2.1　水稻培育和接种方法

　　将水稻种子用 1% 的次氯酸钠消毒 20 min，再用无菌水冲洗掉残留的次氯酸钠，浸种 24 h 后置于温度 30 ℃下催芽 48 h，选取萌发一致的种子播种于 96 孔播种板上。水培营养液配方参照国际水稻研究所(IRRI)推荐的标准，培养条件温度为 14 h 30 ℃ /10 h 28 ℃，湿度为 70%，光照强度为 14 h 20 000 lx/10 h 0lx。

　　挑选大小一致的纹枯病菌菌核(约 1 mm)，用消毒后的镊子轻轻拉开水稻的不完全叶的叶鞘，将菌核放在叶鞘上，接种后将水培盒用保鲜膜罩住保持湿度，培养湿度由 70% 改为 92%，其他培养条件与培育条件一致。病情调查参考行业标准NY/T 2720—2015 水稻抗纹枯病鉴定技术规范。

　　发病度 =(病斑高度 / 苗挺高)9。具体分级为： 0 级—全株无病;1 级—0 < 发病度≤ 1.0;3 级— 1.0 < 发病度≤ 3.0;5 级—3.0 < 发病度≤ 5.0; 7 级—5.0 < 发病度≤ 7.0;9 级—>7.0< 发病度。

　　病情指数 DI= ∑ (Bi×Bd) M×9 ×100。式中，Bi—各级病株数;Bd—病情级别数;M—总株数。相对防效 = 对照病情指数 - 处理病情指数对照病情指数 ×100%。

　　1.2.2　诱抗物的筛选

　　称 取 1.361 7 g BTH 于 50 mL 甲 醇 中， 充分溶解配制成浓度为 0.2 mol/L 母液，分别量取 25.0、50.0、250.0、500.0 μL 的 BTH 母液于去离子水中，使其终浓度分别为 50.0、100.0、500.0、 1 000.0 μmol/L;称取 2.5 g COS 于 50 mL 去离子水中，充分溶解配制成浓度为 50 mg/mL 母液，分别量取 20.0、100.0、200.0、2 000.0 μL 的 COS 母液于去离子水中，使其终浓度分别为 10.0、 50.0、100.0、1 000.0 μg/mL;称取 0.074 8 g PQQ 于 50 mL 去离子水中，充分溶解配制成浓度为 4.0 mmol/L 母液，分别量取 12.5、50.0、200.0、 500.0 μL 的 PQQ 母液于去离子水中，使其终浓度分别为 0.5、2.0、8.0、20.0 μmol/L;将前胡提取液分别稀释 25、50、100、200 倍;将益农分别稀释 200、300、400、500 倍;将翆倍加分别稀释 200、300、400、500 倍。

　　待水稻长至 3 叶 1 心期分别喷施不同浓度的诱导因子，同时喷施清水、井冈霉素作为对照。喷施方法采用喷雾塔喷雾，参数设置为：96 mm/r、行走距离 1 200 mm、前进速度 482 mm/s、回零点速度 150 mm/s。喷施 72 h 后接种纹枯病菌。接种菌核 120 h 后调查发病度。

　　1.2.3　不同浓度 PQQ 处理纹枯病菌

　　将过滤灭菌的 PQQ 加入已灭菌的 PDA 培养基中，使培养基中 PQQ 的终浓度分别为 0.5、1.0、 2.0、4.0、8.0 μmol/L，对照为正常的 PDA 培养基。待培养基平板冷却后，用灭菌的镊子夹取直径为 1 mm 的纹枯病菌菌核接种于平板中央，28 ℃光照培养 24 和 48 h 后测量菌落直径。

　　1.2.4 PQQ 最佳诱导方式的筛选

　　浸种：将消毒后的水稻种子浸泡在浓度为 0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μmol/L 的 PQQ 溶液中 24 h，清水浸泡作为对照，正常催芽、播种，待水稻长至 3 叶 1 心时接种纹枯病菌，接种菌核 120 h 后调查发病度。

　　浸根：正常浸种、催芽、播种，待水稻长至 3 叶 1 心期，向水培液中加入 PQQ 使水培液中 PQQ 浓度分别为 0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μmol/L，正常水培液培养作为对照。培养处理 72 h 后接种纹枯病菌，接种菌核 120 h 后调查发病度。

　　喷施：正常浸种、催芽、播种，待水稻长至 3 叶 1 心期进行 PQQ 喷施，喷施浓度为 0.5、1.0、 2.0、4.0、8.0 μmol/L，清水喷施作为对照。喷施方式与 1.2.2 一致，喷施 72 h 后接种纹枯病菌，接种菌核 120 h 后调查发病度。

　　不同诱导时间：正常浸种、催芽、播种，在水稻 3 叶 1 心期分别喷施浓度为 2.0 μmol/L 的 PQQ 和 清 水， 在 喷 施 24、48、72、96、120、 144 h 后分别接种水稻纹枯病菌，接种菌核 120 h 后调查发病情况。

　　1.2.5　数据处理

　　试验数据采用 Microsoft Excel 2010 软件进行处理，采用 SPSS 22.0 软件进行差异显著性分析，双因素方差分析图采用 R 语言的 HH 包分析，使用 GraphPad Prism 8.0.1 软件作图。

　　2　结果与分析

　　2.1　诱抗物的筛选

　　通过不同浓度诱导因子处理水稻发现 BTH、 COS、PQQ、前胡提取液、益农、翆倍加均能诱导水稻对纹枯病抗性，纹枯病的发生均有不同程度的减轻(表 1)。BTH 处理的相对防效均低于 25.0%;COS 处理中只有浓度 50.0 μg/L 的相对防效大于 30.0%，其余浓度处理的相对防效均低于 15.0%;PQQ 处理中除浓度 20.0 μmol/L 的相对防效低于 15.0%，其他浓度处理的相对防效均高于 25.0%;前胡提取液处理中稀释 100 倍的相对防效大于 35.0%，其余浓度处理相对防效均低于 20.0%;翆倍加处理的相对防效均低于 25.0%;益农处理中只有稀释 300 倍的相对防效大于30.0%，其余浓度处理相对防效均低于 25.0%。

　　不同诱导因子均存在各自的最适处理浓度。 BTH、COS、PQQ、前胡提取液、益农和翆倍加的最适处理浓度分别为 500.0 μmol/L、50.0 μg/L、 2.0 μmol/L、稀释 100 倍、稀释 400 倍和稀释 300 倍(表 1)。不同诱导因子最适浓度处理间的相对防效存在差异(图 1)，最适处理浓度相对防效最低的诱导因子为 BTH 和益农，相对防效分别为 22.8% 和 23.1%;前胡提取液、翆倍加和 COS 最适处理浓度的相对防效分别为 36.2%、34.2% 和 30.1%，而 PQQ 最适处理浓度的相对防效达到 51.0%，明显高于其他诱导因子的相对防效，同时也明显优于对照井冈霉素的相对防效(46.3%)。表明 PQQ 为本试验中的最佳诱导因子。

　　2.2 PQQ 对纹枯病菌菌丝生长的影响

　　通过不同浓度 PQQ 处理纹枯病菌发现 PQQ 对纹枯病菌菌丝生长没有抑制作用(图 2)。在不同浓度 PQQ 处理 24 h 后，浓度 2.0、4.0、8.0 μmol/L 处理的菌核均可正常萌发且菌落直径均大于空白处理，但与空白无显著性差异;处理 48 h 后，浓度 2.0、4.0、8.0 μmol/L 处理的菌落直径均显著大于空白处理，说明 PQQ 对水稻纹枯病菌菌丝生长没有抑制作用，在高浓度处理下甚至会促进菌丝生长。PQQ 可能是直接作用于水稻，诱导水稻对纹枯病抗性，激发水稻自身免疫系统，提高水稻抗逆性，从而减轻水稻纹枯病的发生。

　　2.3 PQQ 诱导方式对诱导效果的影响

　　浸种、浸根和喷施 3 种诱导方式均可降低水稻纹枯病的发生(表 2)，其中以 3 叶 1 心期地上部喷施 PQQ 的诱导方式防治效果最好，浸种次之，浸根效果最差，不同诱导方式处理间差异达到极显著水平(p<0.01)(图 3)。诱导方式和处理浓度之间并无交互作用，影响病情指数的主因为诱导方式，浓度处理影响较小。从图 3 可以看出 3 种诱导方式的病情指数随浓度变化趋势一致，随着浓度升高病情指数明显降低，2.0 μmol/L 时病情指数达到最低，而浓度继续增加导致病情指数呈升高趋势。说明 PQQ 诱导水稻对纹枯病抗性存在最适浓度范围。浸种和喷施处理的最佳作用浓度均为 2.0 μmol/L，浸种处理的病情指数为 35.55%，相对防效为 43.68%;喷施处理的病情指数为 31.86%，相对防效达到了 49.57%。浸根处理浓度间没有明显差异，但病情指数最低的处理浓度为 4.0 μmol/L，相对防效为 17.91%。表明 PQQ 最适的诱导方式为喷施，最适喷施浓度为 2.0 μmol/L。

　　不同诱导时间处理下，诱导 48、72、96、 120、144 h 后的水稻病情指数均低于空白对照(图 4)，其中 48、72、96、120、144 h 的处理病情指数均显著(p<0.05)低于空白对照。说明 PQQ 诱导水稻对纹枯病抗性能持续 144 h 以上。病情指数随诱导时间的增加呈先降后升的趋势。PQQ 喷施 24 h 后相对防效几乎为 0，随着诱导时间增加，病情指数逐渐降低，处理 72 h 后病情指数最低，相对防效达到 50% 以上，喷施 96 h 后病情指数逐渐上升。表明 PQQ 需要一定时间才能诱导水稻产生纹枯病抗性，并且存在最佳的诱导时间，PQQ 诱导处理 72 h 后对水稻纹枯病的防治效果最好。

　　3　讨论

　　纹枯病作为水稻三大病害之一，近年来发病范围扩大且发病程度愈发严重，是水稻减产的重要原因之一。实际生产缺少免疫和抗性品种，对于纹枯病的防治以化学药剂为主，但长期使用会对生态环境造成不可逆转的破坏，而植物诱导抗病性可以通过植物本身的抗性机制来防治病害，是一种经济有效且对环境安全的防治措施，能够兼顾病害防治与环境安全问题。本试验筛选出的最佳诱导因子 PQQ 在水稻苗期相对防效可达 51.0%，远高于其他诱导因子的相对防效，显著优于对照井冈霉素，为 PQQ 的田间应用提供了技术及理论支撑，也为绿色高效防治水稻纹枯病提供新思路。

　　3.1　不同诱导因子对纹枯病诱导效果的影响

　　目前，诱导因子已被作为农药的替代品成功应用于植物病害防控，BTH、COS 是最早发现并用于植物病害防治的诱导因子 [14,18]，但在本研究中这两种诱导因子表现较差。这主要是因为植物诱导抗病虽具有广谱抗性 [19]，但不同致病菌致病力有差异，不同水稻品种间抗病性也存在差异，这就导致同一种诱导因子在诱导不同水稻品种抗性时存在差异。前人对于诱导因子诱导效果的讨论通常只针对 1 个水稻品种或 1 种水稻纹枯病菌，对于诱导因子对水稻纹枯病的广适性研究还鲜有报道，这也是植物诱导抗病性难以大规模推广的重要原因之一。

　　前胡提取液被证实能够诱导水稻对稻瘟病抗性且有较好的防治效果 [9]，但在水稻纹枯病抗性诱导方面还未有报道，本研究中前胡提取液诱导效果并不理想。稻瘟病菌是活体营养性病害，植物通过水杨酸信号途径以激活系统获得性抗性(SAR)，但纹枯病属于死体营养性真菌，植物抵御死体营养性真菌主要通过响应茉莉酸信号途径引发诱导系统抗病性(ISR)[16,20]。对于不同病菌类型，植物响应机制不同，导致同一诱导因子防治效果存在差异，这可能是本研究中前胡提取液诱导水稻对纹枯病抗性效果较差的主要原因。

　　PQQ 具有抗氧化应激、促动植物生长发育的生物学功能 [21-22]。在冷胁迫条件下，PQQ 可以促进 SOD、APX 酶活性升高和抑制 GSH 含量的下降，从而减轻低温胁迫对黄瓜幼苗的伤害 [23]。杜阳 [24] 研究表明 PQQ 在 1 000 μmol/L 浓度下能显著降低四尾栅藻在 H2O2 胁迫下的氧化损伤。李鑫等 [25] 研究认为喷施 200 nmol/L 的 PQQ 能显著提高辣椒的耐旱能力。本研究也表明 PQQ 能够显著降低纹枯病菌对植株的损伤。这表明 PQQ 在植物抗性诱导方面具有重要作用，但其诱导水稻纹枯病抗性的生理和分子机制尚不清楚，需要进一步深入研究。

　　目前，利用微生物高效合成 PQQ 已有大量报道 [26-27]，而 PQQ 与微生物互作的研究却鲜有报道。本研究表明 PQQ 对纹枯病菌菌丝生长没有抑制作用，甚至在中高浓度下会促进纹枯病菌菌丝的生长。这可能是因为高浓度 PQQ 成为了病菌的碳源从而促进其菌丝生长，这其中的作用机制值得进一步探讨，PQQ 可能是通过提高植物本身抗性从而减轻纹枯病的发生，而非抑制纹枯病菌菌丝的生长。

　　3.2　不同诱导方式对纹枯病诱导效果的影响

　　本研究对比了喷施、浸种、浸根3种诱导方式，发现 PQQ 最优的诱导方式为叶面喷施，浸种次之，浸根处理效果不显著。李鑫等 [28] 研究也表明，PQQ 喷施处理相较于灌根更有利于辣椒生长，这可能与 PQQ 的作用机制有关。研究认为，PQQ 一般通过影响相关基因的表达而增加抗氧化酶的总量，减少动植物体内活性氧、自由基的含量，从而促进动植物的生长发育 [23]。水稻根部可能少量存在或不存在 PQQ 作用的受体，导致浸根处理效果不明显，这可能也是 PQQ 不同诱导方式的防治效果存在差异的原因。刘卫群等 [29] 研究表明， PQQ 能够提高烟草种子萌发率，使脂肪酶活性和种子呼吸速率升高。杨雪鹏等 [30] 发现 PQQ 具有促进水芹种子萌发的生理效应。本研究也发现浸种处理的水稻种子较对照发芽率更高且抗病性更好，浸种处理最高防效可达 43.0% 以上。喷施与浸种处理均有较好的防治效果，如同时对水稻进行喷施与浸种处理，是否具有更好的防治效果，还需要进一步试验。

　　本研究发现不同诱导时间处理间的防治效果存在差异，PQQ 诱导处理 24 h 的相对防效几乎为 0，本试验证实 PQQ 至少需要 24 h 才能够激发水稻自身的防卫机制，并在 72 h 达到高峰。这与白春微 [15] 的研究结果一致。李张 [19] 的研究结果表明，农抗 211 诱导水稻纹枯病抗性作用最佳时期为喷施药液后 48 至 96 h。这表明诱导因子诱导植物抗性不会在处理后立刻表达，需要 24 h 以上或更长时间才能诱导植物表达抗病性。

　　3.3 PQQ 的应用前景

　　目前水稻纹枯病的防治还是以井冈霉素等药剂为主，这些化学药剂虽被证实对人体健康无毒副作用，但对粮食和环境安全性存在潜在危害，无法做到绿色安全的防治纹枯病。PQQ 作为新型辅基，已经应用在神经营养、心脏保护、抗癌治疗、调节免疫功能等方面，对微生物、动植物具有广泛的营养作用 [31-32]，市场上已将 PQQ 作为营养补充剂售卖 [33]。将 PQQ 应用于植物病害防治，对人体健康无毒副作用，同时可以保证粮食和环境的安全性，不存在潜在危害，真正做到绿色高效防治纹枯病，且 PQQ 兼具微量高效、方便快捷和易于取得的特点，在植物病害防治方面具有重大的应用价值。Ho 等 [34] 研究也表明，能产生吡咯硝菌素和吡咯并喹啉醌的内生菌可以作为生物防治剂用于枯萎镰刀菌的生物防治和植物推广。本研究首次将 PQQ 应用于水稻纹枯病防治，得到了显著的防治效果。在水稻3叶1心期喷施2.0 μmol/L 的 PQQ 诱导 72 h 能显著提高水稻对纹枯病抗性，减轻发病程度，有效防治水稻纹枯病的发生。这不仅表明了 PQQ 在植物生长和抗逆方面的巨大潜能，也为防治水稻纹枯病提供了新思路。本文只研究了 PQQ 对水稻苗期纹枯病的防治效果，而纹枯病多发于水稻分蘖末期和灌浆期，对于田间应用的效果及作用条件还需进一步开展研究。