梁山慈竹DfMYB3基因克隆及启动子分析

　　摘要 基于梁山慈竹转录组数据库，以梁山慈竹叶片为材料，克隆得到一个MYB转录因子，命名为DfMYB3，其开放阅读框长度为 1 287 bp，编码 428 个氨基酸，GenBank 注册号为 KY963358。保守结构域分析显示，Df⁃ MYB3有典型的SANT结构域，具有DNA-Binding结构域。系统进化树分析发现，DfMYB3与甘蔗、拟南芥、毛白杨等物种的R2R3-MYB转录因子聚集在一枝上。亚细胞定位结果显示，DfMYB3蛋白在细胞核以及细胞膜中均有表达，在细胞核上更为显著。通过染色体步移法克隆得到 DfMYB3基因 5′侧翼 2 000 bp左右的序列。Plant⁃ CARE在线软件分析表明，该序列具有典型的启动子特征，并含有 GA、ABA、MeJA等激素以及干旱等胁迫响应元件。100 μmol·L-1 GA、100 μmol·L-1 ABA处理梁山慈竹后，显著上调了 DfMYB3基因的表达，表明 DfMYB3基因能对 GA及 ABA处理产生应答。为探究 DfMYB3启动子的功能，构建了 DfMYB3启动子融合 GUS基因的表达载体，并遗传转化烟草。在转基因烟草叶片及茎杆中都检测到了GUS信号，在叶脉处最为显著。

　　本文源自杜恬恬; 李会萍; 王博雅; 欧倩; 黄艳; 曹颖; 胡尚连， 植物研究 发表时间：2021-05-07《植物研究》1959年创刊，是由东北林业大学主办，科学出版社出版的植物学专业刊物，是国内外公开发行的学术期刊。2006年变更为双月刊。《植物研究》本刊是以植物分类、基因工程、植被生态、数量遗传学等为核心的多学科综合性学术期刊。

　　关键词 梁山慈竹; MYB转录因子;启动子;GA、ABA处理;GUS染色

　　MYB转录因子是最重要的植物转录因子大家族之一，参与了植物生长的许多生理过程。第一个从植物中获得的 MYB 基因是玉米的 Clorless1 (C1)转录因子[1]，随后在棉花[2]、大豆[3]、拟南芥[4]等植物中的 MYB 蛋白也被鉴定出来。MYB 转录因子结构域中包含DNA-Binding结构域，根据结构的不同，可分为 1R-MYB、2R-MYB(R2R3-MYB)、 3R-MYB(R1R2R3-MYB)和4R-MYB 4类蛋白[5]，其中 R2R3-MYB 是最大的一类转录因子，广泛参与了植物的生长发育调控[6]、次生壁的形成[7]、初级和次级代谢[8]、胁迫响应以及激素应答[9]等。如棉花 R2R3-MYB 转录因子 GhMYB7 在棉纤维发育中高表达，GhMYB7过表达拟南芥会增加维管和胞间纤维的细胞壁厚度，以及激活次生壁生物合成相关基因的表达，导致纤维素和木质素的异位沉积[10]。拟南芥 R2R3-MYB转录因子 AtMYB60在莴苣中抑制会花青素的合成，过表达 AtMYB60 会导致莴苣花青素的产生和积累受到抑制[11]。麻疯树 R2R3-MYB 转录因子 JcMYB1 经干旱、聚乙二醇、氯化钠和冷处理后表达量均上调，ABA 和茉莉酸处理也可上调 JcMYB1 的表达，而乙烯不诱导 Jc⁃ MYB1 的表达，揭示了 JcMYB1 在响应非生物胁迫中的重要作用[12]。

　　MYB转录因子在非生物胁迫以及激素应答方面有较多的研究。Chen等通过对拟南芥全基因组的 序 列 分 析 ，在 MYB 超 家 族 中 鉴 定 出 126 个 R2R2-MYB 转录因子，大多数 MYB 基因能够响应一种或多种激素以及胁迫应答[4]。芥菜BjMYB1-3 和 BjMYB1-4 基因在拟南芥中的过表达表现出种子提前萌发、促进生长以及对渗透胁迫或高盐胁迫的耐受性提高现象[13]。小麦 TaMYB1 基因在缺磷条件下表达量上调，过表达TaMYB1植株比野生型表现出更多的磷积累，提示TaMYB1在磷饥饿胁迫耐受性方面起关键作用[14]。过表达紫花扁豆 R2R3-MYB 转录因子 LpMYB1 转基因拟南芥可以提高耐盐性和耐旱性，转基因种子的发芽势也有所提高[15]。玉米 ZmMYB30基因在脱落酸(ABA)、聚乙二醇(PEG)、NaCl、低温 4 种胁迫下表达水平均明显上调，ZmMYB30转基因拟南芥异位表达促进了植物的耐盐性，同时非生物胁迫相关基因的表达量也有所增加，提高了植物的抗逆性[16]。

　　目前，MYB转录因子在水稻、拟南芥等模式植物和毛竹等散生竹中研究较多，但在梁山慈竹等丛生竹中，MYB 转录因子的研究却鲜见报道。梁山慈竹是我国主要经济竹种之一，广泛分布于四川、云南、贵州、广西等全国各地[17]，是一种优良的笋材两用竹种，具有纤维含量高且质量好，生物量大等特点。本研究基于梁山慈竹转录组数据库，从梁山慈竹叶片中克隆得到一个 MYB 转录因子，命名 DfMYB3，对其进行了生物信息学分析、亚细胞定位，以及启动子分析，为将来进一步研究梁山慈竹 DfMYB3 转录因子的功能提供一定的理论基础。

　　1 材料和方法

　　1. 1 植物材料

　　梁山慈竹生长于西南科技大学生命科学与工程学院植物资源圃，叶片采集后迅速置于液氮中速冻，并于-80℃超低温冰箱中保存。梁山慈竹当年生侧枝条用于激素处理，分别用100 μmol·L-1 的赤霉素(GA)、100 μmol·L-1 的脱落酸(ABA)对梁山慈竹侧枝条进行处理，以 H2O 为对照，喷洒处理 5 d，用于检测 DfMYB3 基因的表达量变化。野生型烟草NC89无菌苗由本实验室保存，组培室中光照16 h/黑暗8 h生长。

　　1. 2 试剂

　　RNA 提 取 试 剂 盒 Omega Bio-Tec Plant RNA Kit 购自 OMEGA 公司，cDNA 反转录试剂盒 Prime Script®RT reagent Kit prefect real Time，Genome Walking Kit 试剂盒以及 pMD19-T 载体均购自 Ta⁃ KaRa 公司，PCR 扩增试剂盒 Q5 High-Fidelity 2X Master Mix购自NEB公司，实时荧光定量PCR试剂盒 SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)SuperReal 购自天根公司。农杆菌 EHA105菌株，DH5α大肠杆菌感受态、pART27 载体以及改造过的 pBI 载体由本实验室保存。

　　1. 3 方法

　　1. 3. 1 DfMYB3基因克隆

　　叶片总 RNA 由 Omega Bio-Tec Plant RNA Kit 试剂盒提取，之后用 Prime Script®RT reagent Kit prefect real Time 反 转 录 试 剂 盒 合 成 cDNA。 用 Primer Premier 6.0 软件设计特异性引物 DfMYB3- F/R(引物序列见表 1)。采用 NewEnglandBiolabs (NEB)公司的 Q5 High-Fidelity 2X Master Mix 试剂盒，扩增DfMYB3转录因子。PCR反应程序为98℃ 预变性 30 s，98℃变性 10 s，67℃退火 20 s，72℃延伸 40 s，30 个循环，72℃延伸 2 min。扩增产物与 pMD19-T 载体连接，转化 DH5α 大肠杆菌，进行蓝白斑筛选。将阳性单菌落菌液送至上海英潍捷基公司进行测序。

　　1. 3. 2 DfMYB3生物信息学分析

　　用 NCBI 在线工具 Conserved 对 DfMYB3 进行保守结构域预测分析。用 ProtParam 在线工具对 DfMYB3 基因编码的蛋白进行分子量、理论等电点、稳定指数、氨基酸个数等理化性质指标的测定。用SOPMA在线工具对DfMYB3蛋白进行二级结构预测。SWISS-MODE 在线工具对 DfMYB3 蛋白进行三级结构预测。以 DfMYB3 的氨基酸序列为探针，从国家水稻数据中心、植物转录因子数据库、NCBI三种数据库中获得多条有功能的MYB序列，将氨基酸序列导入MEGA7.0筛选最适模型，采用最大似然法(Maximum Likehood)构建系统进化树(Bootstrap 参数为 1000)。用 PlantCARE 在线网站对DfMYB3启动子序列进行元件分析。

　　1. 3. 3 实时荧光定量PCR

　　Omega Bio-Tec Plant RNA Kit 试剂盒提取 GA、ABA处理后的梁山慈竹侧枝条 RNA，用 Prime Script®RT reagent Kit prefect real Time 试剂盒反转录成 cDNA，并利用 Primer Premier6.0软件设计 Df⁃ MYB3 基因的 qRT-PCR 特异性引物 RT-DfMYB3-F/ R(引物序列见表1)，以Tublin作为内参基因，Tub⁃ lin-F/R 引物序列见表 1。用 SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)SuperReal 试剂盒进行 qRT-PCR 反应，分析 DfMYB3 基因的表达量变化情况。采用 2-ΔΔCT对DfMYB3基因的相对表达量进行计算，并用 Duncan法进行差异显著性分析。

　　1. 3. 4 DfMYB3亚细胞定位

　　用 BioEdit 软件分析 DfMYB3 基因的所有酶切位点，用 Primer Premier6.0 软件设计特异性引物 DfMYB3-F(KpnⅠ)和 DfMYB3-R(HindⅢ)(引物序列见表 1)，与含有绿色荧光蛋白(GFP)的 pART27 载体连接。将重组质粒 DfMYB3-pART27 转入水稻白化苗原生质体中，以DAPI细胞核染色作为阳性对照，在激光共聚集显微镜下观察DfMYB3融合 GFP蛋白的表达情况。

　　1. 3. 5 DfMYB3启动子克隆

　　梁山慈竹 DfMYB3 基因序列通过与毛竹的同源 MYB 序列比对，设计 3 条同向特异的引物 SP1、 SP2、SP3(引物序列见表 1)。CTAB 法提取梁山慈竹叶片基因组 DNA，以基因组 DNA 为模板，利用染色体步移法克隆DfMYB3上游启动子序列。Ge⁃ nome Walking Kit 试剂盒中的 AP1、AP2、AP3、AP4 引物与设计的 3 条特异引物 SP1、SP2、SP3 进行热不对称PCR反应。3次巢式PCR反应后可获得Df⁃ MYB3基因的侧翼序列。

　　1. 3. 6 DfMYB3 启动子转基因烟草植株的获得及GUS染色

　　用 BioEdit 软件分析 DfMYB3 启动子的酶切位点，用 Primer Premier6.0 软件设计特异性引物 pDf⁃ MYB3-F(HindⅢ)和 pDfMYB3-R(XbaⅠ)(引物序列见表1)，将克隆得到的DfMYB3启动子连接含有 GUS 报告基因的改良 pBI 载体，构建 pDfMYB3：： GUS 重组质粒，通过叶盘法转化烟草。提取转基因及野生型烟草植株的DNA，进行PCR阳性验证。阳性转基因烟草苗在GUS染液(1 mL磷酸缓冲液， 0.1 mL TritionX-100，0.2 mL K3Fe(CN)6，0.2 mL K4Fe(CN)6，10.4 mg X-Gluc，补水定容至 10 mL)中进行组织染色，37℃培养箱放置过夜，然后用卡诺固定液(无水乙醇∶冰醋酸=3∶1)进行脱色。

　　2 结果与分析

　　2. 1 DfMYB3基因克隆及生物信息学分析

　　基于梁山慈竹转录组数据库，以梁山慈竹叶片为材料，克隆得到一个 MYB 转录因子，命名为 DfMYB3。测序结果显示，DfMYB3 基因的开放阅读框长度为 1 287 bp(见图 1A)，编码 428 个氨基酸，GenBank 注册号为 KY963358。理化性质分析显示，DfMYB3 的分子量为 47.33 KD，酸性残基数大于碱性残基数，理论等电点为 6.12。稳定指数结果显示，DfMYB3 编码的是不稳定蛋白。Df⁃ MYB3 的脂肪族氨基酸指数为 65.00，总亲水性平均系数为-0.644。保守结构域分析显示，DfMYB3 含有两个典型的 SANT 结构域(见图 1B)，具有 DNA-Binding 结构域。二级结构分析显示，Df⁃MYB3蛋白中无规卷曲含量最丰富，为 60.51%，其次是 31.78% 的 α-螺旋，β-转角和延伸链含量最少，分别为3.97%和3.74%(见图1C)。蛋白三级结构显示，DfMYB3 蛋白的三维结构与 B-MYB DNA 结合域蛋白1a5j.1.A模型最为相似(见图1D)。

　　系 统 进 化 树 分 析 显 示 ，DfMYB3 与 甘 蔗 Sc2RMyb1，毛白杨 PtoMYB216，拟南芥 AtMYB55 和 AtMYB4，以及水稻 OsMYB46 和 OsMYB103L 聚集在一起(见图 2)，同源性较高。这些物种的 MYB 序 列 都 属 于 典 型 的 R2R3-MYB 转 录 因子[18~19]，而且没有单子叶、双子叶植物的差异。

　　2. 2 DfMYB3亚细胞定位

　　为了研究DfMYB3蛋白的亚细胞定位情况，构建了 DfMYB3 融合绿色荧光蛋白(GFP)的重组质粒 DfMYB3-pART27，并转入水稻白化苗原生质体中进行瞬时表达。以DAPI细胞核染色作为参照，在激光共聚焦显微镜下观察GFP的表达情况。结果显示，在细胞膜以及细胞核中都检测到了 GFP 荧光信号(见图3)，但在细胞核中更为显著。

　　2. 3 DfMYB3启动子克隆及元件分析

　　以梁山慈竹基因组 DNA 为模板，利用染色体步移法克隆得到 DfMYB3 上游 2 000 bp 左右的 5′ 侧翼序列。PlantCARE在线分析结果表明，该序列上含有启动子元件TATA box、CAAT box，以及2个脱落酸(ABA)响应元件 ABRE、1 个生长素响应元件 AuxRR-core，8 个茉莉酸甲酯(MeJA)响应元件 CGTCA-motif 和 TGACG-motif，1 个赤霉素(GA)响应 元 件 GARE-motif，1 个 水 杨 酸(SA)响 应 元 件 TCA-element，2 个干旱响应元件 MBS，以及 4 个光响应元件(见表2)。

　　2. 4 DfMYB3基因对GA和ABA处理的响应

　　启动子元件分析发现，DfMYB3启动子序列上存在多个激素响应元件。为探究DfMYB3对GA及 ABA 处理的响应情况，采用实时荧光定量 PCR (qRT-PCR)检测了 DfMYB3基因在 100 μmol·L-1 的 GA、100 μmol·L-1 的 ABA 处理下的表达量变化情况。以水为对照，分别用 100 μmol·L-1 的 GA、100 μmol·L-1 的 ABA 对梁山慈竹当年生侧枝条进行喷洒处理，5 天后提取侧枝条的 RNA 进行 qRT-PCR 分析。结果显示，GA 及 ABA 处理均显著上调了 DfMYB3 的表达。GA 处理后 DfMYB3 的表达量是对照的1.6倍，ABA处理后DfMYB3的表达量更高，达到了对照的7.6倍(见图4)。

　　2. 5 DfMYB3启动子的功能分析

　　为研究 DfMYB3 启动子的活性，构建了 Df⁃ MYB3 启动子融合 GUS 报告基因的 pDfMYB3：： GUS 载体。通过叶盘法转化烟草，获得了 12 株抗性植株。DfMYB3 启动子序列的 PCR 分析结果表明，有9株烟草抗性苗扩增出与阳性对照一致的特异性条带，证实 pDfMYB3：：GUS 已成功整合到烟草基因组中(见图5)。GUS组织染色结果表明，在转基因烟草叶片的主叶脉和次叶脉中有明显的 GUS 信号(见图 6A)，但在茎杆中 GUS 信号较弱(见图 6B)。对茎秆进行徒手切片后发现，在茎杆的表皮、皮层、维管组织以及髓细胞中均存在GUS 信号(见图 6C~D)，表明 DfMYB3 启动子在烟草中没有明显的组织特异性(见图6)。

　　3 讨论

　　MYB 转录因子广泛存在于各种植物中，在植物的生长发育过程中起十分重要的作用。本研究克隆得到一个梁山慈竹MYB转录因子，命名为Df⁃ MYB3。进化树分析显示，DfMYB3与毛白杨、拟南芥等的R2R3-MYB转录因子聚集在一起。MYB转录因子根据结构域的不同可分为 4 类蛋白，其中 R2R3-MYB 是最大的一类 MYB 蛋白，广泛参与了一系列植物生理过程，包括激素应答[20]、胁迫响应[21]、次生壁形成[22]等。转录因子通常定位在细胞核中[23]，调控下游基因的转录，但也有转录因子同时定位于细胞核以及其他部位，如水稻的 ASR 蛋白同时定位于细胞核和细胞质中[24]。丹参 R2R3-MYB 转录因子 SmMYB87 的亚细胞定位研究发现，SmMYB87蛋白在细胞核和细胞膜上均有分布[25]。本研究的亚细胞定位结果显示，在细胞核以及细胞膜中均检测到了 GFP 信号，表明 Df⁃ MYB3蛋白在细胞核以及细胞膜中均有表达，但在细胞核中更为显著。

　　启动子是能够调控基因表达的顺式作用元件。蓝莓VcMYB启动子转基因拟南芥能驱动GUS 基因在拟南芥中表达，并且经ABA、低温和光照处理后，转基因拟南芥中 GUS 的表达活性增强[26]。海岛棉MYB转录因子GbMYB5基因的启动子能够驱动 GUS 报告基因在拟南芥的根部、叶尖部及生长点表达，推测该启动子是一个组织特异性启动子[27]。启动子元件分析发现，DfMYB3启动子序列上含有启动子元件TATA box以及CAAT box，具有典型的启动子特征。DfMYB3 启动子转基因烟草GUS 组织染色发现，GUS 信号在烟草叶片的叶脉以及茎杆中都被检测到，在叶脉处最为显著，表明 DfMYB3启动子具有启动子活性，能够驱动GUS基因的表达，且DfMYB3启动子在烟草中没有明显的组织特异性。

　　研 究 表 明 ，小 麦 R2R3-MYB 转 录 因 子 Ta⁃ MYB33，其启动子序列包含 ABRE、MYB 等非生物胁迫相关元件，过表达拟南芥增强了干旱和 NaCl 胁迫的耐受性，并且提高了渗透压平衡重建和活性氧清除能力[21]。甘蔗胁迫相关的 MYB 转录因子 ScMYBAS1 表现出对水分缺失和盐胁迫的诱导反应，对启动子 PScMYBAS1 的缺失分析表明，777 bp 或更长的启动子片段在非生物胁迫(脱水、盐、冷、伤)和激素(SA、MeJA)处理下，GUS 的诱导率增加了 2~4 倍[28]。巴巴多斯棉 R2R3-MYB 转录因子 GbMYB60受 ABA 以及盐等胁迫诱导，GbMYB60 转基因拟南芥 ABA 相关基因表达量下调，揭示了棉花 GbMYB60 基因可能通过抑制 ABA 信号来负调节植物对盐胁迫的耐受性[29]。烟草 R2R3-MYB 转录因子 NtMYB44b经 100 mg·L-1 GA、10 μmol·L-1 ABA 处理后，相对表达水平显著上调，推测 Nt⁃ MYB44b 能对上述浓度的 GA 及 ABA 处理产生应答[30]。金鱼草 MYB 转录因子 AmDIV 的拟南芥同源蛋白AtDIV2参与了ABA信号传导，在外源ABA 胁迫下，AtDIV2 的表达水平显著增加[31]。菊花 R2R3-MYB 转录因子 CmMYB2 经外源 ABA 处理后，菊花叶中的 CmMYB2 表达量上调[32]。本研究的qRT-PCR分析结果显示，DfMYB3基因的相对表达量经GA、ABA处理后均显著上调，表明DfMYB3 基因能对 GA 及 ABA 处理产生应答。DfMYB3 启动子序列上存在 MBS 干旱胁迫响应元件等，需要进一步的研究来探讨 DfMYB3 是否在非生物胁迫中起作用。