塔里木河下游柽柳灌丛土壤真菌群落结构及多样性分析

　　摘要：土壤真菌群落对干旱区土壤生态系统功能的维持具有重要作用。为研究新疆干旱地区柽柳沙包和非沙包土壤理化性质对土壤真菌群落结构的影响，该实验采集了塔里木河下游英苏断面附近沙包柽柳灌丛和非沙包柽柳灌丛的冠幅内部、冠幅边缘和灌丛边缘 3 个位置的土壤，基于高通量测序对沙包柽柳灌丛和非沙包柽柳灌丛土壤真菌群落结构及功能进行初步研究，结合土壤理化性质，分析沙包和土壤因素对土壤真菌群落结构和功能的综合影响。结果表明：(1)土壤 pH、速效钾、全钾、铵态氮、速效磷在柽柳灌丛的不同位置存在显著性差异，而土壤含水量、电导率、总盐、有机质、全氮、全磷、硝态氮在整个柽柳灌丛中均无显著性差异。(2)该区域柽柳灌丛土壤真菌分为 1 界，14 门，48 纲，110 目，227 科，410 属，557 种。在门水平上，子囊菌门、担子菌门和被孢霉门为该区域柽柳灌丛主要的优势菌门，在属水平上，链格孢属、曲霉属、Stolonocarpus、刺盘孢属、unidentified_Saccharomycetales_sp、裸子囊菌属为柽柳灌丛的主要优势菌属。(3)通过分析土壤理化因子与土壤真菌群落的关系，发现全氮、速效钾、铵态氮是影响土壤真菌群落结构的主要环境因子，全磷与曲霉属、Microthelia、裸子囊菌属、Phialosimplex 均呈显著正相关关系，全氮与链格孢属呈显著正相关关系。(4)基于 FUNGuild 真菌功能预测，在柽柳灌丛中共检测到腐生、共生、病理 3 类营养型和 5 类互有交叉营养型功能菌群，其中腐生营养型(30.0%)功能真菌在柽柳灌丛中占据主导优势，其次是病理–腐生–共生营养型(10.6%)、病理–共生营养型(5.9%)、共生营养型(4.3%)在柽柳灌丛中占据一定的优势。(5)研究发现柽柳沙包和柽柳冠幅对土壤养分和土壤真菌的富集效应不明显，但在沙包冠幅内功能真菌与其它组存在明显差异，说明柽柳灌丛沙包和冠幅的综合效对土壤真菌功能组成有较大的影响。

　　本文源自肖方南; 姜梦; 李媛媛; 党寒利; 彭梦文; 庄丽， 干旱区地理 发表时间：2021-04-09 17:01 期刊《干旱区地理》(双月刊)创刊于1978年，由中国科学院新疆生态与地理研究所和中国地理学会主办、科学出版社出版。获奖情况：1994-1996、1997-1999年度科技期刊质量评比优秀期刊三等奖;2000～2001年: 新疆维吾尔自治区科技期刊《干旱区地理》汉文版荣获优秀期刊二等奖。、2002～2003年: 在新疆维吾尔自治区科技期刊质量评比中 ，《干旱区地理》汉文版荣获“新疆科技期刊奖”，也被评为科技期刊“一级期刊”。2004年: 在第三届新疆期刊评选奖评选活动中,《干旱区地理》荣获第三届“新疆期刊奖”。 被评为科技期刊“一级期刊”。

　　关键词：高通量测序;功能基因预测;沙包;土壤真菌群落;柽柳

　　塔里木河是中国最长的内陆河，河岸荒漠植被是维系塔里木河流域生态系统稳定的基础。柽柳作为塔里木河下游流域的优势种，具有抗干旱、耐盐碱[1]、防风固沙[2,3]的特性和功能，在维护脆弱的生态系统中具有重要的作用。柽柳沙包广泛分布于塔里木河流域，能够富集周围土壤的养分从而形成“肥岛”，对柽柳的生长发育具有积极的促进作用[4,5]。目前对于“肥岛效应”的研究主要集中在土壤养分方面，利用高通量测序从微生物的角度去研究柽柳灌丛的“肥岛效应”这方面却鲜有报道。土壤微生物是自然环境中主要的分解者，可以参与到土壤的物质循环和能量转化过程中去，是土壤中的重要肥力因子[6]，可以有效反映土壤的健康状况[7]。在干旱、半干旱地区，植物灌丛所营造的局部环境对土壤微生物的生长繁殖具有积极促进作用，同时在沙包形成的过程中土壤微生物能够推动着“肥岛”的发育[8,9]。目前已有专家学者通过传统培养的方法，发现土壤微生物在柽柳沙包冠幅内外有不同的变化[10]。然而，土壤微生物除了可培养的细菌外，还有像真菌、放线菌等许多不可培养的微生物，它们对土壤生态系统也起着十分重要的作用，目前尚未见有相关系统研究报道。真菌作为微生物的主要成员，其分布广泛，具有很好的适应逆境胁迫的能力[11,12]。在干旱胁迫条件下真菌能促进宿主植物吸收水分和养分，有利于植物生长代谢活动[13]，是土壤生态系统是否健康的指示物[14]。

　　本研究基于高通量测序技术，对塔里木河下游流域沙包和非沙包柽柳灌丛土壤真菌及土壤理化性质进行分析研究，探讨不同分类水平土壤真菌在柽柳沙包灌丛和非沙包灌丛中的分布机理，以及沙包和土壤因素对土壤真菌群落和功能的综合影响。以期探寻影响柽柳生长的优势菌群和为塔里木河流域植被的生态恢复提供理论基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 研究区概况

　　本次实验的研究区域处于塔里木河下游英苏断面附近，地理坐标为 40°28′—40°30′N， 87°51′—87°52′E，海拔在 830～850m，该研究区域属典型的极端干旱温带大陆气候，干旱少雨，蒸发强烈。年降水量为 17.4～42.0 mm，蒸发量为 2671.4～2902.2 mm。年平均气温在 10.6℃～11.5℃之间。夏日炎热、冬季酷寒，夏季 7 月份平均气温为 20℃～30℃，35℃以上的高温达 30～40 天;最高气温 43.6℃。冬季 1 月份平均气温为-10℃～-20℃，最低气温达 -27.5℃，日照时间为 2780 ～ 2980 h，全年太阳辐射 5692 ～ 6360 MJ·m-2，无霜期达 187～ 214 天，最大风速 20～40 m·s-1[15]。该区域分布的乔木主要是胡杨(Populus euphratica Oliv);灌木主要有柽柳(Tamarix spp)、盐穗木(Halostachys caspica);草本植物主要有骆驼刺(Alhagi sparsifolia Shap.ex Kell)、甘草(Glycyrrhiza uralensis)等植物，柽柳为该地区灌丛的优势种。

　　1.2 实验设计与样品采集

　　我们于 2020 年 9 月，在塔里木河下游英苏断面附近的柽柳植物群落进行土壤样品的采集，在样地内分别选取大小基本一致的 3 个沙包柽柳灌丛(X)和 3 个非沙包柽柳灌丛(F)。以冠幅内植株基部为中心，按距离植株基部的远近从冠幅内部(a)、冠幅边缘(b)和灌丛边缘 (c)由内到外呈辐射状采集土样(每个位置间距 1m)。具体方法：去掉 0～20cm 的极干旱表层土壤，以植株基部为中心，从东南西北 4 个方向的冠幅内部、冠幅边缘和灌丛边缘位置分别采集深度 20～40 cm 的 4 个土样混合，然后按四分法除去多余土样，每个样品土样分为 3 份，第 1 份放入冰盒并立即称量土壤鲜重，带回实验室放入烘箱烘干后进行土壤含水量的测定;第 2 份装入密封袋中带回实验室在室内风干后，过 2mm 的筛进行土壤理化性质的测定;第 3 份装入离心管中，放入液氮罐中保存，用于 DNA 的提取。

　　1.3 测定方法

　　土壤理化性质测定采用鲍士旦测定方法[16]，具体土壤因子、测定方法及仪器见表 1。

　　基因组 DNA 的提取：采用 CTAB 方法对样本的基因组 DNA 进行提取，之后利用琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 的纯度和浓度，取适量的样本 DNA 于离心管中，使用无菌水稀释。以稀释后的 DNA 为模板，使用带 Barcode 的 特 异 引 物 (ITS5-1737F ‘GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG’，ITS2-2043R‘GCTGCGTTCTTCATCGATGC’)， New England Biolabs 公司的 Phusion® High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer，和高效高保真酶进行 PCR，确保扩增效率和准确性。PCR 产物使用 2%浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测，对目的条带使用 qiagen 公司提供的胶回收试剂盒回收产物。使用 TruSeq® DNA PCR-Free Sample Preparation Kit 建库试剂盒进行文库构建。构建好的文库经过 Qubit 和 Q-PCR 定量，文库合格后，使用 NovaSeq6000 进行上机测序(北京康普森生物技术有限公司)。

　　测序完成后，截去下机数据的 Barcode 和引物序列，通过 FLASH[17]软件进行拼接，再利用 Qiime[18]软件对数据进行质控并去除嵌合体[19]，得到最后的有效数据(Effective Tags)。使用 Uparse[20]软件根据 97%的一致性将序列聚类成为 OTUs，将 OTUs 序列与 Unit 数据库[21] 进行物种注释，获得并统计各分类水平上的数据信息。

　　1.4 数据分析

　　使用 Qiime 软件进行 Alpha 多样性分析，包括 Chao1 指数、香农⁃威纳指数、辛普森指数、ACE 指数、覆盖度。使用 R 软件(Version 2.15.3)绘制非度量多维尺度分析(Nonmetric multidimensional scaling，NMDS)图、基于距离的冗余分析(Distance-based redundancy analysis， db-RDA)图和 Spearman 相关性热图进行 Beta 多样性分析。通过与 FUNGuil 数据库对比对真菌功能进行分析。使用 SPSS(Version22.0)软件分别对沙包和非沙包柽柳灌丛不同位置土壤理化性质和土壤真菌 Alpha 多样性的数据进行单因素方差分析(one-Way ANOVA)并做多组间两两均数比较(LSD);通过配对样本t检验对沙包和非沙包柽柳灌丛土壤理化性质以及土壤真菌Alpha 多样性进行差异性分析。

　　2 结果与分析

　　2.1 柽柳灌丛土壤理化性质分析

　　研究区土壤 pH 在 7.5～8.0 之间，属于弱碱性土壤，pH 在沙包柽柳灌丛中要显著高于非沙包灌丛，但在灌丛内部无显著性差异。在沙包和非沙包柽柳灌丛中，电导率、总盐、全磷、全氮、速效钾、速效磷、硝态氮均在冠幅内部表现出最大值。速效钾的含量显著高于其它土壤养分，在柽柳灌丛中表现出由内到外逐渐减少的趋势，并在沙包灌丛中具有显著性差异，但在沙包和非沙包灌丛之间无显著性差异。全钾含量在沙包灌丛中显著大于非沙包灌丛，并在非沙包灌丛中存在显著性差异。铵态氮在非沙包灌丛边缘位置中表现出最大值，并显著高于灌丛内部的其它位置，整体上铵态氮在非沙包灌丛中显著大于沙包灌丛。速效磷在灌丛中表现为内部显著高于外部，但在沙包和非沙包之间无显著性差异。而土壤含水量、总盐、电导率、有机质、全氮、全磷、硝态氮在整个柽柳灌丛中均无显著性差异(表 2)。

　　2.2 柽柳灌丛土壤真菌 Alpha 多样性分析

　　各组的 OTU 覆盖度均高于 99%，表明具有足够的测序深度。香农⁃威纳指数、辛普森指数、Chao1 指数和 ACE 指数在沙包和非沙包柽柳灌丛中均无显著差异，说明各灌丛中真菌丰度、多样性和均匀度差异并不明显(表 3)。

　　2.3 柽柳灌丛土壤真菌群落物种组成分析

　　通过与数据库 UNITE 比对，共获得 2005 个 OTU，其中，能够注释到数据库的 OTUs 占 62.99%。在不同的分类水平上，共检测到 1 界，14 门，48 纲，110 目，227 科，410 属， 557 种。分别在门和属水平上选取丰度排名前 10 的门和前 30 的属，生成物种相对丰度柱形图进行分析。门水平上(图 1)，发现占据主导地位是子囊菌门，远远大于其它菌门，其平均相对丰度为 65.5%。子囊菌门在沙包柽柳灌丛的冠幅内部具有最大相对丰度(80.5%)，在非沙包柽柳灌丛边缘相对丰度最小(49.8%)。担子菌门和被孢霉门为第二大优势菌门，其平均相对丰度分别占 4.4%和 2.5%。剩余的菌门平均相对丰度均未超过 1%。

　　在 属 水 平 上 ( 图 2 ) ， 链 格 孢 属 、 曲 霉 属 、 Stolonocarpus 、 刺 盘 孢 属 、 unidentified-Saccharomycetales-sp、裸子囊菌属为柽柳灌丛的主要优势菌属，其平均相对丰度分别占 8.9%、7.7%、5.8%、5.2%、5.1%，4.3%。其余平均相对丰度超过 1%的优势菌属有 Plectosphaerellaceae-unidentified(2.5%)，Neomicrosphaeropsis(2.2%)，Microthelia(2.0%)， Mortierellaceae-unidentified(1.6%)，梭孢壳属(1.6%)，Phialosimplex(1.3%)。在不同的分组中，各自的优势菌属也不尽相同。在沙包柽柳灌丛中，曲霉属是冠幅内部和冠幅边缘的主要优势菌属，其相对丰度分别为 25.3%和 11.5%。Plectosphaerellaceae-unidentified 为灌丛边缘的主要优势菌属，其相对丰度为 14.9%。在非沙包灌丛中，冠幅内部、冠幅边缘、灌丛边缘各自的主要优势菌属分别是链格孢属( 21.1% ) 、 Stolonocarpus ( 30.2% ) 、 unidentified-Saccharomycetales-sp(11.5%)。

　　2.4 柽柳灌丛土壤真菌群落结构 NMDS 分析

　　非度量多维尺度分析(NMDS)是基于 Bray-Curtis 距离来进行分析的非线性模型，根据样本中包含的物种信息，以点的形式反映在二维平面上，能够反映出生态学数据的非线性结构。NMDS 可以低维分析样本之间差异性，样品距离越大差异越显著。当应力值小于 0.2 时，表示分析结果可用。此次 NMDS 分析的应力值为 0.095，说明数据合理可用，可用于 NMDS 分析。如图 3 所示，沙包柽柳灌丛样品较非沙包柽柳灌丛样品分布较为分散，这说明沙包柽柳灌丛内部真菌群落结构差异性要大于非沙包柽柳灌丛。除个别样品分布距离较远以外，总体上样品主要在第 3 象限集中分布，说明沙包和非沙包柽柳灌丛的土壤真菌群落结构具有一定的相似性，差异并不明显。

　　2.5 土壤理化性质对柽柳灌丛土壤微生物群落结构的影响

　　从属水平上对柽柳灌丛土壤真菌和土壤理化性质进行基于距离的冗余分析(db-RDA)。 db-RDA 分析是一种基于距离的冗余分析，适用于任何距离矩阵，能够反映基于菌群的距离与环境因子之间的关系。如图 4 所示，横、纵坐标对各土壤样品真菌群落组成差异的贡献值分别为 20.25%和 18.35%，两者共解释 38.60%的方差变异。经 db-RDA 分析，全氮(R 2 =0.581， P=0.002)，速效钾(R 2 =0.359，P=0.018)，铵态氮(R 2 =0.347，P=0.032)与真菌群落相关性显著，是影响真菌群落结构的主要环境因子。

　　通过 Spearson 热图对柽柳灌丛真菌群落中相对丰度排名前 35 的属与环境因子进行相关分析，从图 5 中可以得知，在相对丰度较高的优势菌属中，曲霉属与全磷、速效钾、电导率、总盐呈极显著正相关关系(P <0.01)，但与全钾呈显著负相关关系(P <0.05)。Microthelia 与有机质、全磷呈极显著正相关关系，与速效磷呈显著正相关关系，但与土壤含水量呈极显著负相关关系。裸子囊菌属与全磷呈显著正相关关系，链格孢属与全氮呈显著正相关关系。 Phialosimplex 与全磷呈极显著正相关关系，与速效钾呈显著正相关关系，但与全钾呈极显著负相关关系。

　　2.6 柽柳灌丛土壤真菌基群落因功能预测

　　基于真菌的物种分类，通过 FUNGuild 数据库对比，预测柽柳灌丛土壤真菌群落的营养型。如图 6 所示，柽柳灌丛土壤真菌群落主要包括 3 类营养型和 5 类互有交叉营养型功能菌群，分别是腐生营养型、共生营养型、病理营养型、病理-腐生-共生营养型、病理-共生营养型、病理-腐生营养型、病原-腐生-共生营养型、腐生-共生营养型，剩余的是未定义的营养型。柽柳灌丛土壤真菌群落的营养型以腐生营养型(30.0%)为主，占据着主导优势，其次是病理-腐生-共生营养型(10.6%)、病理-共生营养型(5.9%)、共生营养型(4.3%)在柽柳灌丛中占据着一定的优势。而对植物有害的病理营养型(1.7%)平均相对丰度较低。通过对比分析，发现腐生营养型和共生营养型含量在沙包柽柳灌丛要高于非沙包灌丛，并且在沙包和非沙包灌丛冠幅内部要高于灌丛其他位置。

　　腐生营养型和共生营养型在沙包柽柳灌丛冠幅内部显著高于其它组(图 7)，病理-腐生营养型和病原-腐生-共生营养型在沙包柽柳灌丛边缘显著高于其它组，病原-腐生-共生营养型在非沙包柽柳灌丛冠幅内部中显著高于其它组，病理营养型在非沙包柽柳灌丛边缘中显著高于其它组。同时，从图中可以看出，沙包柽柳灌丛边缘和非沙包柽柳灌丛边缘、沙包柽柳灌丛冠幅边缘和非沙包柽柳灌丛冠幅边缘最先聚为一类，说明各自对应两个组之间土壤真菌的功能菌群结构相似度最高。沙包柽柳灌丛冠幅内部最后与其它组聚为一个大类，说明沙包柽柳灌丛冠幅内部土壤真菌的功能菌群结构与其它组存在较大的差异。

　　3 讨论

　　土壤资源的空间异质性是干旱半干旱区的一种普遍现象[22]，灌丛沙包对土壤养分和盐分的富集作用也是导致土壤资源空间异质性的重要机理之一。在本次研究中，除 pH、全钾、铵态氮外，其余土壤因子在沙包柽柳灌丛和非沙包柽柳灌丛中并没有表现出显著性差异。陈鸿洋等人[23]认为，在灌丛沙堆发育的过程中，能不断提高沙堆土壤的养分含量。因此我们推测有可能是所选取的柽柳灌丛沙包所形成的年份不久，对土壤养分的富集并不明显。在沙包和非沙包柽柳灌丛中，有机质、全氮、全磷、速效钾、电导率、总盐均在冠幅内部表现出最大值，且在沙包柽柳灌丛冠幅内部高于非沙包柽柳灌丛冠幅内部,这说明除了沙包对土壤养分富集效果外，冠幅也能一定程度聚集土壤周围养分。这是因为冠幅内土壤靠近植株根部，植物根系分泌物含各种无机离子、糖类、氨基酸等化合物 ,为周围土壤提供了更多的营养源和能量源[24,25]，并且冠幅内枯枝落物的降解也能一定程度改善土壤环境条件。

　　通过对柽柳灌丛土壤真菌群落 Alpha 多样性分析发现，土壤真菌群落多样性与丰度在沙包和非沙包柽柳灌丛中差异并不明显。通过对土壤真菌群落结构 NMDS 分析，也发现沙包和非沙包柽柳灌丛土壤真菌群落结构具有一定的相似性，可能是灌丛内土壤理化因子差异不明显，也可能是土壤微生物所处的大环境土壤性质大致相同的原因。

　　在门水平上，子囊菌门占据着主导地位，这与众多干旱区方面的研究结果一致[26,27]。子囊菌门含大量土壤腐生真菌，具有分解木质化植被碎屑的功能[28]，子囊菌门在沙包柽柳灌丛冠幅内部含量最高，有可能是因为沙包和冠幅对土壤养分的富集效应，为子囊菌门真菌提供了适宜的土壤环境，使其更好地利用可降解植被的凋落物，促进菌群的快速增长与繁殖。在属水平上，链格孢属、曲霉属、Stolonocarpus、刺盘孢属、unidentified_Saccharomycetales_sp、裸子囊菌属为柽柳灌丛的主要优势菌属，且这些优势菌属均来自子囊菌门，这与郭成瑾等人[29]对沙漠固沙植物根际土壤真菌研究结果相似。其中链格孢属[30]和刺盘孢属[31]属于病原菌，对植物有一定的侵害作用。曲霉属在自然界分布极广，部分曲霉素具有很强的酶活性，具有降解土壤木质素的能力[32]，是引起多种物质霉腐的主要微生物之一。

　　土壤真菌群落结构与土壤理化因子的相关分析发现，全氮、速效钾、铵态氮是影响土壤真菌群落结构的主要环境因子。氮与钾是植物所需营养物质，这些物质能促进植物生长发育，增加土壤肥力[33]，同时也能为微生物的新陈代谢提供营养元素。影响着土壤真菌的数量、种类以及群落结构。在土壤理化因子与土壤真菌 Spearson 相关性分析中，全氮、全磷、速效钾、电导率、总盐、土壤含水量与不同的优势菌属有着不同的显著性影响。这可能是不同菌属的生理特性和生活习性不同，对土壤因子表现出不同的偏好性。

　　基于真菌基因功能预测，发现柽柳灌丛土壤真菌群落腐生营养型(30.0%)占据着主导优势，而对植物有害的病理营养型(1.7%)含量较低，这说明柽柳灌丛真菌群落结构组成比较健康。沙包柽柳灌丛冠幅内部、非沙包柽柳灌丛冠幅内部功能菌与其它组存在一定的结构差异，尤其沙包柽柳灌丛冠幅内部与其它组存在显著差异。这说明沙包和冠幅对土壤真菌营养型具有一定的影响，并且沙包和冠幅的综合效应对柽柳灌丛的土壤真菌营养型具有显著影响。另外，本研究中还有 17.6%~53.2%的功菌能没能注释出来，在柽柳灌丛中的真菌功能方面仍有待进一步研究。

　　4 结论

　　本文以塔里木河下游沙包柽柳灌丛和非沙包柽柳灌丛为研究对象，基于高通量测序对沙包柽柳灌丛和非沙包柽柳灌丛土壤真菌群落结构及功能进行初步研究，结合土壤理化性质，分析了沙包和土壤理化性质对土壤真菌群落结构和功能的综合影响，得出以下结论：

　　(1)柽柳灌丛沙包和冠幅对土壤养分、盐分和土壤真菌数量有一定的富集作用，但对大多土壤因子富集效应不显著。

　　(2)本研究共获得 2005 个 OTU，在不同分类水平上注释到 1 界 14 门 48 纲 110 目 227 科 410 属 557 种，在门分类水平，子囊菌门、担子菌门和被孢霉门为柽柳灌丛主要的优势菌门，在属分类水平，链格孢属、曲霉属、刺盘孢属为柽柳灌丛的主要优势菌属。

　　(3)全氮、速效钾、铵态氮是影响土壤真菌群落结构的主要环境因子。全磷与曲霉属、 Microthelia、裸子囊菌属、Phialosimplex 均呈显著正相关关系，全氮与链格孢属呈显著正相关关系。

　　(4)在柽柳灌丛中共检测到 3 类营养型(腐生、共生、病理营养型)和 5 类互有交叉营养型功能菌群，其中土壤真菌群落的营养型以腐生营养型为主，其沙包和冠幅的综合效应对土壤真菌功能组成有较大的影响。

　　由于本次实验所选取的沙包灌丛形成年份不久，导致沙包对土壤养分的富集以及土壤真菌的影响不明显。在今后的研究中，可以从选取沙包年龄较大的灌丛以及不同土壤深度方面去对土壤微生物进行深入研究，以期对塔里木河生态恢复提供更多基础、科学的数据。