真菌群落多样性及组成结构对不同耕作模式的响应机制

　　摘 要: 为揭示东北黑土玉米田土壤真菌群落对旋耕、深松、深翻和秸秆还田四种耕作方式的响应机制，在长期定位种植区采集旋耕(RT)、深松(SU)、深松秸秆覆盖(SS)和深翻秸秆还田(DP)土壤样品，依托 Illumina MiSeq 高通量测序平台，研究了土壤真菌群落结构及其与土壤环境因子的相关关系。结果表明: 4 个处理共获得 1724 个可操作分类单元 ( OTUs) 。子囊菌门和担子菌门为土壤中优势菌门，其相对丰度总和为 78.64%~85.05%。SU、 SS 处理下子囊菌门粪壳菌纲(Sordariomycetes)的相对丰度最高，DP 处理下担子菌门银耳纲 ( Tremellomycetes)的相对丰度最高。土壤中腐生菌群、与玉米共生的内生菌和外生菌根菌在 SS 中相对较高。4 个处理真菌群落多样性指数依次为 SS>RT>SU>DP。多元分析结果表明，土壤纤维素酶活性、速效钾、有机质、速效磷、土壤碱解氮与土壤真菌群落结构显著相关。Ascomycota 与速效钾极显著相关，Basidiomycota 与 pH 极显著正相关，与土壤纤维素酶活性极显著负相关。在黑龙江西部玉米种植地区以深松秸秆覆盖的耕作模式有利于提高土壤真菌群落多样性。

　　本文源自宋秀丽; 盘雨薇; 孙士明; 王俊河; 靳晓燕; 庞爱国; 于晓波; 金新月; 郝天乐; 宋翔雨; 杨德光， 玉米科学 发表时间：2021-04-09 17:31 期刊《玉米科学》(双月刊)创刊于1992年，是由吉林省农业科学院主办的我国惟一的玉米专业学术期刊，在国内外玉米界具有较大影响。

　　关键词: 玉米;真菌;群落结构;多样性;高通量测序

　　土壤微生物是土壤生态系统的核心，土壤微生物群落结构决定土壤功能[1,2]。气候条件、土壤类型、土壤理化性质、植被类型和人类干扰活动与土壤微生物群落结构和功能相关[3]。与细菌相比，目前有关土壤真菌的研究主要集中在不同地域、不同土壤理化性质条件下真菌群落分布特征[4]，真菌群落结构与功能对土地利用方式、施肥方式、植被类型的响应[5]，以及真菌群落结构与土壤有机碳的相关关系等[6,7]。但我国幅员辽阔，地域环境条件及相关影响因素差异显著，因此对土壤真菌群落的研究总体相对薄弱[8]。

　　在农业生产过程中，优化集成耕作模式是现代农业的重要措施之一[9]。获得作物高产稳产，一般采用施用化肥、有机肥、秸秆还田与耕作方式进行优化集成 [10,11]。选择合理耕作模式，维持、改善土壤微生物群落结构和多样性，对提高农田土壤生产力，增强土壤缓冲、抗逆能力具有重要意义[12,]。黑龙江西部地区土壤沙化严重、保水保肥能力相对较差，学者们尝试开展免耕、翻耕、旋耕、有机肥、秸秆还田等方式构建耕层，改善土壤肥力，但是关于不同耕作方式下真菌群落结构和功能多性的研究鲜有报道，研究不同耕作方式土壤微生物群落结构特征可以为选择和评价种植模式提供理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 研究区自然概况

　　实验地位于黑龙江省齐齐哈尔富拉尔基区(47.2623° N, 123.6886° E)，中温带大陆性季风气候，年平均气温 3.2℃，全年有效积温 2700℃左右，降水集中 7 —8 月，年降雨量 415mm。试验前土壤 pH 为 8.35，有机质含量 13.33 g·kg-1，全氮含量 0.78 g·kg-1，碱解氮含量 58.04 mg·kg-1，全磷含量 0.82 g·kg-1，速效磷含量 47.77mg·kg-1，速效钾含量 311.5 mg·kg-1。

　　1.2 实验设计

　　试验开始于 2015 年 10 月，为长期定位试验，地势平坦均匀，设有免耕、深松、深松秸秆还田和深翻秸秆还田四个处理，采用随机区组设计，3 重复，小区面积 27 m×50m。旋耕处理(RT)：秋季玉米净茬处理，旋耕深度 12~16cm，春季免耕播种;深松处理(SU)：秋季玉米净茬处理，深松 30~35cm 以上，春季免耕播种;深松秸秆还田(SS)：秋季玉米秸秆全量还田。玉米机械收获秸秆粉碎联合作业，留茬高度 5~10cm，秸秆切碎长度要小于 10cm，抛撒均匀，深松 30~35cm。春季免耕播种;深翻秸秆还田(DP)：秋季玉米秸秆全量还田。采用玉米机械收获秸秆粉碎联合作业，玉米留茬高度 5～10cm，秸秆切碎长度小于 10cm，抛撒均匀，深翻犁深翻 30～35cm，扣垡严密，耙深 10～14cm。春季免耕播种玉米嫩单 19，种植期内统一管理。2019 年 10 月作物收获后，在各小区利用“S”形 5 点取样法采集 0～30 cm 土壤样品，冰盒保存带回实验室，所有土壤样品过 2 mm 网筛，除去杂物，一份储存于-80℃ 低温冰箱用于土壤真菌多样性的测定，一份自然风干进行土壤理化指标的测定。

　　1.3 测定项目与方法

　　1.3.1 土壤真菌 DNA 提取和 PCR 扩增

　　土壤真菌总 DNA 提取采用 Fast DNA SPIN kit 试剂盒(MP Biomedicals，美国) ，严格按照说明书中的操作步骤进行 DNA 提取。采用真菌特异引物 (ITS1F/2043R) 对真菌 18S rRNA 基因的 ITS1F-ITS2 区段进行扩增，正向引物为 ITS1F (5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3') ， 反 向 引 物 为 2043 R (5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3') 。PCR 反应体系见参考文献[13]。采用 Illumina Mi Seq 测序平台对 PCR 扩增产物进行双端测序，测序委托上海天昊生物科技有限公司完成。

　　1.3.2 高通量测序数据分析

　　采用 Illumina Miseq 平台对真菌 DNA 进行双端测序。根据 Barcode 序列和 PCR 扩增引物序列从下机数据中拆分和拼接出各样品数据，采用滑动窗口法对 FASTQ 格式的双端序列原始数据逐一质量筛查。运用 QIIME 软件( v1.8.0) 识别疑问序列，通过调 USEARCH (v5.2.236)检查并剔除嵌合体序列; 随后调用 UCLUST 序列比对工具，对前述获得序列按 97%的序列相似度进行归并和 OTU 划分，并选取每个 OTU 中丰度最高的序列作为该 OTU 的代表序列。根据每个 OTU 在每个样本中所包含的序列数，构建 OTU 丰度矩阵; 通过将 OTU 代表序列与对应 UNITE 数据库的模板序列比对，获取每个 OTU 所对应的真菌分类学信息，得到 OTU 代表序列的系统发育地位[14]。通过 FUNGulid 对真菌微生物群落进行功能注释。使用 QIIME 软件，对 Weighted 的 UniFrac 距离矩阵进行非加权配对平均法( UPGMA)分析，采用 Mothur 软件计算 Simpson、Shannon、Chao1 和 ACE 指数[15]。

　　1.3.3 土壤化学性质测定

　　土壤 pH 值 按水土比 2.5:1，采用 pH 计测定;土壤有机质(SOM)采用重铬酸钾容量法;碱解氮采用扩散法;速效磷用 0.5 mol/L NaHCO3 浸提-钼锑抗比色法;速效钾用 1 mol/L NH4OAc 浸提-火焰光度法。土壤蔗糖酶活性(S-SC)用 3,5-二硝基水杨酸显色法测定，活性以 24h 内 1g 土中葡萄糖的毫克数表示;土壤脲酶活性(S-UE)用苯酚钠次氯酸钠显色法测定，活性以 24h 内 1g 土中 NH4+ -N 的毫克数表示;土壤过氧化氢酶活性(S-CAT)用高锰酸钾滴定法测定，活性以每克土中的 0.1mol·L-1 KMnO4 的毫升数表示;土壤纤维素酶活性(S-CL)用 3,5-二硝基水杨酸比色法测定，纤维素酶活性以 72h 内 1g 干土生成葡萄糖毫克数表示。

　　1.4 数据处理

　　采用 Excel 2010、SUS7.05 软件进行数据整理和统计分析。各处理组间物种差异比较采用 Lefse 分析。利用 R 软件、Origin 2018b 软件绘制物种累计曲线、韦恩图及各分类学组成分布图，多元分析采用 Canoco 5.0。

　　2 结果与分析

　　2.1 不同耕作方式土壤真菌 OTU 分析

　　不同处理土壤真菌群落共形成有 1724 个 OTU (图 1)，四个处理共有 392 个 OTU，占总 OTU 数的 22.7%。RT、SS、DP 和 SU 中特有 OTU 分别为 205、193、 201 和 161 个。RT、SS、DP 和 SU 的 OTU 数分别为 993、910、908 和 916。RT 处理 OUT 数最多，DP 最小。此外，RT 和 SS 共有 OTU 为 589，DP 和 SU 共有 OTU 为 541，RT 和 SU 共有 OTU 为 622，SS 和 DP 共有 OTU 为 521，深松、翻耕与秸秆还田措施都降低了土壤中真菌种类数。

　　2.2 不同耕作方式土壤真菌群落α多样性分析

　　土壤真菌群落丰度( Chao1 和 ACE)表现为 RT>SU>DP>SS，各处理间差异不显著(表1)。土壤真菌群落多样性(Shannon和Simpson)表现为SS>RT>SU>DP。与 RT 相比 SS 土壤真菌 Shannon 指数增加了 1.3%。而 SU 和 DP 与 RT 相比分别下降了 1.8%和 13%。秸秆覆盖能够增加土壤真菌多样性，深翻秸秆还田处理土壤真菌多样性指数显著最低。

　　2.3 不同耕作方式对土壤真菌群落组成结构的影响

　　子囊菌门和担子菌门是土壤真菌菌群的优势菌门，子囊菌门( Ascomycota) 相对丰度最高(图 2)，子囊菌门和担子菌门的相对丰度约占菌群的 78.64%～ 85.05%。子囊菌门相对丰度在 SS、SU、RT 中显著高，相对丰度分别为 67.19%、 68.98%和 69.58，在 DP 处理中相对丰度显著低，相对丰度为 52.92%。其中，深翻秸秆还田显著降低了子囊菌门的相对丰度; 与 SS、SU 和 RT 处理相比，相对降低了 21%、23%和 24%。

　　担子菌门( Basidiomycota)的相对丰度与子囊菌门相对丰度表现出相反的趋势，担子菌门在 DP 处理中显著高，相对丰度为 32.13%，而在其他处理中相对丰度为 11.45%～14.21%，免耕、深松和秸秆覆盖处理显著降低了担子菌门的相对丰度。被孢霉门 ( Mortierellomycota) 的相对丰度处于 8.46%～14.94%之间，在 SU 中显著最高，其次为 SS 处理(P<0.05)。未能归类的真菌(Unassigned)在 RT 中显著高，在 SS 中次之。球囊菌门(Glomeromycota)在 RT 和 DP 中显著高，相对丰度为 3.98%和 3.74%，在 SU 中相对丰度为 0.76%，在 SS 中 0.14%。不同处理下“其他真菌”的相对丰度较低，仅占 0%～0.24%之间。

　　子囊菌门真菌主要 由粪壳菌纲( Sordariomycetes )、 座 囊 菌 纲 ( Dothideomyce-tes) 、盘菌纲( Pezizomycetes) 、锤舌菌纲( Leotiomycetes)和散囊菌纲( Eurotiomycetes)组成 (表 2) 。不同处理下粪壳菌纲(Sordariomycetes)的相对丰度 17.2%～34.7%，在 DP 中显著低，相对下降了 49%～51%。座囊菌纲的相对丰度为 12.2%～15.4%，盘菌纲( Pezizomycetes)的相对丰度在 11.4%～ 13.9%，各处理间差异不显著。锤舌菌纲 ( Leotiomycetes)的相对丰度在 RT 处理中显著低，在 DP 处理中显著高，DP 与 RT 处理相比锤舌菌纲( Leotiomycetes) 的相对丰度相对增加了 54.2%。散囊菌纲( Eurotiomycetes)的相对丰度在 SU 中显著最高，在 DP 中最低，各处理间差异显著。担子菌门真菌主要由银耳纲 ( Tremellomycetes)和伞菌纲( Agaricomycetes)构成。银耳纲是各处理中的优势菌纲，其相对丰度在 10.7%～30.4%。伞菌纲的相对丰度则显著下降，相对丰度仅占真菌总数的 0.25%～1.27%。与 RT 相比，DP 处理显著提高了银耳纲的相对丰度(P<0.05)，伞菌纲 ( Agaricomycetes)各处理间无明显差异。被孢霉门(Mortierellomycota)中被孢霉纲(Mortierellomycetes)为优势菌，相对丰度为 8.46%～14.94%，在 SU 中最高，SS 中次之，各处理间差异显著。未分配菌门(Unassigned)中未分配菌纲(Unassigned)在 RT 处理中显著高，相对丰度为 10.43%。球囊菌门(Glomeromycota)中球囊菌纲(Glomeromycetes)为优势菌群，各处理间差异不显著。

　　2.4 不同耕作方式土壤真菌群落结构的差异

　　不同耕作方式在各分类单元形成了显著差异变化 (图 3) 。在门水平上，担子菌门(Basidiomycota)的相对丰度在 DP 处理中显著高，与其他处理均存在显著差异; 球囊菌门(Glomeromycota)的相对丰度在 RT 中显著高与其他处理均存在显著差异。不同处理形成了具有显著差异类群的真菌微生物群落。通过组间群落差异( LEfSe) 分析，对不同处理产生显著影响的真菌物种类群共有 79 类。4 个处理间具有显著差异的真菌类群 40 个(图 4)。其中，对 DP 处理起重要作用的类群有 11 个，包括担子菌门(Basidiomycota)、久浩酵母属(Guehomyces)、囊丝担子菌目(Cystofilobasidiales)目、囊丝担子菌科(Cystofilobasidiaceae)等 11 个类群。SS 中起重要作用的类群有 Vibrisseaceae 科、Phialocephala 属、列壳属(Schizothecium)等 8 个类群。对 SU 处理起重要作用的肉座菌目( Hypocreales)、丛赤壳科(Nectriaceae)科、肉座菌科(Hypocreaceae)、木霉菌属(Trichoderma)、散囊菌纲(Eurotiomycetes)、 赤霉属(Gibberella)等 14 类。RT 中其重要作用的是粪壳菌目(Sordariales)、荚孢腔菌科(Sporormiaceae)、光黑壳属(Preussia)、球囊菌门(Glomeromycota)、球囊菌纲(Glomeromycotes)等 7 个类群。

　　在不同处理土壤中寄生真菌中只有植物病原菌(Plant Pathogen)在不同处理中呈现极显著的差异性，在 SU 处理中显著高，其次是 SS、DP，在 RT 处理中最低(图 5)。在不同处理中有 7 类腐生真菌呈现显著差异，木质腐生菌( endophyte/lichen parasite/wood saprotroph )、 排 泄 腐 生 菌 (dung saprotroph/endophyte/undefined saprotroph) 、 排 泄 腐 菌 / 未 定 义 腐 生 物 (dung saprotroph /undefined saprotroph)在 DP 中显著高，木质腐 endophyte/lichen parasite/wood saprotroph ) 生 菌 在 RT 中 最 低 ， 排 泄 腐 生 菌 (dung saprotroph/endophyte/undefined saprotroph)在 SU 和 SS 中最低。腐生菌 anima pathogen/undefined saprotroph)、Animal endosymbiont/animal pathogen/undefined saprotroph 在 SU 处理中显著高。植物腐生菌 dung saprotroph/plant saprotroph 在 RT 处理中显著高，其次是 SS 中较高。排泄腐生菌(dung saprotroph)在 SS 处理中显著高，其次是 RT 中较高。与玉米共生的内生菌(Endophyte)和外生菌根(Ectomycorrhizal)在 SS 中显著高。

　　2. 5 不同处理土壤真菌群落与土壤理化性状间的多元分析

　　土壤真菌物种组成与土壤 S-CL 显著相关，与土壤 S-CL、土壤速效钾、有机质、速效磷、土壤碱解氮组合环境因子显著相关(表 3)。Ascomycota 菌群与土壤速效钾含量极显著相关，与 P 和 S-UE 显著相关(图 6)。Basidiomycota 菌群与土壤中 PH 极显著正相关，与 S-CL 极显著负相关，与土壤速效磷显著负相关。 Mortierellomycota 与土壤速效 N、K 显著正相关。Glomeromycota 菌群与土壤速效 K、S-UE 极显著负相关，与土壤速效 N 显著负相关，与 S-CAT 显著正相关。 Olpidiomycota 菌门与 S-CAT 显著负相关。Cercozoa 与速效 K 极显著相关，与 S-UE 显著正相关。

　　3 结论与讨论

　　3. 1 不同耕作措施对土壤真菌丰度和多样性的影响

　　本研究中，常规处理土壤真菌丰富度显著高，这与前人研究结果一致，传统耕有利于某些特定种类微生物的大量繁殖，不利于真菌多样性的增加[16]。Sun 等 [17]研究发现有机肥会显著增加土壤真菌多样性[18]，在本研究中秸秆覆盖显著增加了土壤真菌的多样性，这与秸秆还田有机物料的增加和秸秆覆盖后土壤有机质、土壤温度与湿度的增加具有相关关系[19]。深翻秸秆还田模式显著降低了土壤真菌数量和真菌多样性，土壤中真菌在土壤中通过菌丝伸长和分枝来繁殖，强烈增加土壤扰动会显著改变土壤通气形状，土壤温度、湿度以及土壤理化性质，从而降低土壤真菌数量和多样性[20]。因此旋耕、深松、翻耕和秸秆覆盖等耕作措施通过改变土壤物理结构、土壤孔隙的通气性、透水能力等理化性质来选择不同的真菌类群，导致土壤真菌群落丰度和多样性显著变化[21,22]。本研究中，土壤纤维素酶活性与土壤真菌群落显著相关，而关于纤维素酶活如何指示真菌群落结构还有待进一步研究。

　　3.2 不同耕作措施对土壤真菌群落组成的影响

　　土壤真菌群落是植物残体的主要分解者，是评价自然或人为耕作干扰下土壤变化的重要指标[23]。农田土壤真菌群落受耕作措施、施肥因素影响显著[20]。特别是土壤中优势类群与土壤、作物、栽培模式密切相关。农田退耕后子囊菌门、担子菌门和接合菌门是农田生态系统中的优势真菌类群[24]。长期有机和无机肥配施会促使真菌群落组成向子囊菌门、担子菌门和接合菌门方向演替[25]。而本研究中子囊菌门和担子菌门为优势菌门，而接合菌门为成为优势菌群，其变化规律及其影响因素有待进一步研究。本研究深松和秸秆覆盖还田后子囊菌门的相对丰度显著高，高于旋耕和深松不覆盖处理，而深翻秸秆还田显著降低了子囊菌门的相对丰度。Boer 等[26]研究指出，保护性耕作与传统耕作下土壤真菌菌群中子囊菌门均为主导类群，受耕作措施影响小[27]。一定程度的耕作和扰动为子囊菌门提供了适宜的环境，使其更好地利用可降解的作物残茬，因此菌群丰度较高[25]。子囊菌门属于土壤腐生真菌，其功能是分解木质化植被碎屑，因此植物种类和秸秆残茬显著影响子囊菌门的相对丰度[26]。在本研究中不同处理形成了不同优势类群的腐生菌群，总体上深松秸秆覆盖和旋耕处理腐生菌群丰度和种类较高，说明旋耕和秸秆覆盖影响下的土壤理化环境，例如土壤温度、湿度可能更利于腐生菌群的生长。本研究中子囊菌门优势菌纲 Sordariomycetes 在深翻秸秆还田中显著最低，而在深翻秸秆还田中子囊菌门的 Leotiomycetes 菌纲显著高，结果与刘红梅等人的结果不一致[28]，原因是因为不同类型土壤上，耕作措施、施肥种类、还田秸秆量以及归还方式的不同真菌群落结构会显著不同[17]。旋耕、深松、深翻和秸秆覆盖影响了土壤理化环境，最终引起土壤真菌群落结构发生显著改变，其具体演变机制还需要通过针对具体真菌类群的功能及其与土壤物理化学性质之间的关系来进一步揭示。