27种植物提取物抗烟草花叶病毒活性分析
摘要：以烟草花叶病毒(TMV)为模式病毒，采用半叶枯斑法及叶圆片法，对27种植物提取物的抗TMV活性进行筛选。结果表明：在浓度为1mg/mL时12种植物提取物对TMV有治疗作用，其中藿香蓟对TMV的治疗作用最显著，抑制率为53.06%，与阳性对照药剂宁南霉素(57.33%)相比无显著差异。8种植物提取物对TMV侵染具有保护效应，其中马桑的保护活性最高，抑制率达53.64%;其次为银胶菊和黑蒿，抑制率分别为46.51%和36.63%。9种植物提取物对TMV有体外钝化作用，其中革命菜、荨麻和藿香蓟3种植物提取物的钝化活性较强，抑制率分别是62.20%、54.92%和51.75%。22种植物提取物对TMV增殖有抑制活性，且活性高于或相当于阳性对照宁南霉素处理组，其中水麻、香丝草处理组的病毒含量相当于健康烟叶，表明其能完全抑制TMV增殖。
本文源自西南林业大学学报(自然科学),2020,40(05):93-99.《西南林业大学学报》是由西南林业大学主办的林业类综合性学术期刊，主要刊登森林生物学、林木遗传育种、森林培育、森林保护、森林经理、野生动植物保护与利用、园林植物与风景园林、水土保持与荒漠化防治、木材科学与技术及林产化学等方面具有创新性的原始科研成果。读者对象为国内外农林科技工作者及高等院校师生。该刊1981年创刊，国内外公开发行，面向全国组稿。
病毒是仅次于真菌的第二大作物病害，素有“植物癌症”之称[1]。烟草花叶病毒(TMV)侵染的寄主范围很广，可侵染茄科、十字花科、菊科等36科400多种植物[2]。由TMV引发的烟草花叶病毒病是烟草的主要病害，造成烟草产量和品质的严重下降，且TMV性质稳定在环境中极易通过植物和机械工具传播，给烟草产业带来严重损失。我国南方烟草种植地区，烟草早期发病造成的损失可达50%～70%[3,4]。通过化学药剂防治烟草花叶病毒病是现在主要的防治措施，但大量使用化学药剂会使烟草花叶病毒产生耐药性，同时带来环境污染问题，严重影响人类健康。迄今为止尚未发现能彻底防控TMV的生物药剂，因此筛选并开发高效、低毒的植物病毒抑制剂十分迫切。
全世界有1/3的药物均是从植物中开发而来。植物中含有丰富的次生代谢物质，这些次生代谢物形成的病毒抑制剂作用方式独特，具有良好的环境兼容性。研究抗病毒药剂的一个重要来源是从植物提取物中筛选活性物质[5]。许多药物研发项目中，天然产物是重要且可行的先导化合物来源[6]。我国植物资源丰富，目前已发现多种植物提取物具良好的抗TMV活性[7,8,9]。从植物中寻找抗TMV活性物质是开发抗病毒药剂的一个重要来源。本研究对27种植物提取物进行初步抗TMV活性筛选，为开发新型抗病毒制剂提供依据。
1、材料及方法
1.1试验材料
1.1.1供试植物
27种植物材料于2018年5—8月采自云南昆明、广西宾阳、辽宁喀左等地，具体信息见表1。
表1供试植物名录
1.1.2供试病毒
由云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所提供的烟草花叶病毒普通株系U1。繁殖于普通烟K326上，采用魏远方[10]的方法进行烟草花叶病毒提纯，浓度用紫外分光光度计测定为16mg/mL，置于-80℃冰箱中保存，备用。
1.1.3供试寄主
TMV局部侵染寄主心叶烟、TMV系统侵染寄主普通烟K326，漂盘育苗，移栽于无虫温室中培育，待烟苗长至4～6片真叶时进行活性测定。
1.2试验方法
1.2.1植物提取物的制备
植物材料风干粉碎，称取200g样品，乙醇回流提取3次，每次4h，合并并浓缩3次提取液，得乙醇提取物，二甲基亚砜(DMSO)溶解称取的一定提取物，配成100mg/mL母液，置于4℃冰箱备用，临时用蒸馏水稀释置1mg/mL。
1.2.2抗TMV活性测定
采用活体半叶枯斑法测定提取物对TMV侵染的抑制活性[11]。挑选健康长势一致的4～6叶龄心叶烟，每株挑选中上部大小相似3个叶片，采用3种施药方式：1)先施药，将提取物喷洒在烟叶片上，6h后用金刚砂摩擦接种病毒，以测定各提取物对感染TMV烟叶的保护作用;2)混合施药，将不同提取物与病毒混合30min后用金刚砂接种病毒，测定提取物对TMV的体外钝化作用;3)后施药，用金刚砂接种病毒6h后在烟叶上喷施各稀释后的提取物，以测定不同提取物对TMV的治疗作用;左半叶喷施1mg/mL供试提取物作为试验组，右半叶喷相同浓度的DMSO溶液作为对照组，将烟苗放在无虫温室中培养，3～4d后待枯斑症状明显时，统计试验结果，按以下公式计算抑制率。
采用叶圆片法测定提取物对TMV增殖抑制活性[12]。挑选长势一致的健康普通烟，喷施1mg/mL提取物作为处理;喷施相同浓度的DMSO溶液作为对照;以800倍液宁南霉素为阳性对照药。施药24h后每株烟挑选一片中上部叶片摩擦接种TMV，接种TMV后48h打直径为1cm的圆片，每片叶片取10个圆片于离心管，保存在-70℃冰箱，每个处理重复3次，以间接ELISA法检测病毒含量。以喷施1mg/mLDMSO溶液，不接种TMV的烟苗作为健康对照[13]。
2、结果与分析
2.1提取物对烟草花叶病毒的抑制活性
先施药结果(表2)表明，马桑提取物对TMV的抑制活性最强(图1a)，抑制率为53.64%，与阳性对照药宁南霉素间无显著差异;其次为银胶菊，抑制率为46.51%;再次为黑蒿，抑制率为36.63%;银胶菊与马桑的活性差异不显著，但显著高于黑蒿、紫红獐芽菜、大蓟、小花鬼针草、忍冬、革命菜6种提取物的抑制率，对TMV侵染有一定保护作用。紫红獐牙菜、大蓟、小花鬼针草、忍冬、革命菜5种植物提取物对TMV侵染烟草也有一定的保护作用，抑制率介于10%～30%。其余19种植物提取物未显示出保护活性。
表28种植物提取物对TMV的保护作用
注：数据为3次重复取平均值，提取物浓度为1mg/mL，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
施药结果表明(表3),12种植物提取物对TMV侵染有治疗作用，其中藿香蓟提取物的治疗效果(图1b)最强抑制率为53.06%，与阳性对照宁南霉素的抑制率56.84%差异不显著;此外天名精、青蒿、全叶马兰、马桑4种提取物的治疗活性也较好，抑制率介于40%～45%;紫红獐牙菜、络石、革命菜、角蒿、荨麻、银胶菊、牛尾蒿7种植物提取物对烟草花叶病毒也有一定治疗作用，抑制率介于10%～40%;其余15种植物提取物对TMV无治疗活性。
表312种植物提取物对TMV治疗作用
2.2提取物对烟草花叶病毒的钝化活性
混合施药结果表明(表4),9种植物提取物对TMV有不同程度的钝化活性，其中革命菜(图1c)、荨麻钝化活性显著，抑制率分别为62.20%和54.92%，与阳性对照宁南霉素无显著差异;藿香蓟和角蒿的抑制率分别为51.75%和40.81%，与革命菜、荨麻的钝化活性差异不显著，但显著低于宁南霉素;角蒿提取物对烟草花叶病毒的体外钝化作用抑制率为40.81%，次于上述3种植物提取物;鱼眼草、牛尾蒿、土木香、马桑、女萎5种植物提取物对烟草花叶病毒的体外钝化作用介于10%～40%;剩下的18种植物提取物均对烟草花叶病毒无体外钝化活性。
图1活体半叶枯斑法试验结果
a.马桑保护作用b.藿香蓟治疗作用c.革命菜钝化作用左半叶为处理，右半叶为对照。
表49种提取物对TMV的钝化作用
2.3提取物对烟草花叶病毒的增殖活性
病毒衣壳蛋白(CP)是病毒在寄主体内移动的标记，病毒在寄主体内的增殖可以通过病毒衣壳蛋白在寄主体内的积累量来表现[12]。本研究采用普通烟叶圆片法结合间接ELISA法检测了经27种植物提取物处理后普通烟叶圆片中烟草花叶病毒蛋白衣壳的累积情况，检测结果见图2。与对照相比除大蓟、小花鬼针草、金腰箭、香青兰、马桑5种提取物外，其余22种提取物对TMV增殖均有一定的抑制活性。其中革命菜、藿香蓟、络石、老鹳草、角蒿5种提取物与宁南霉素无显著差异，表明这些提取物抑制TMV增殖的活性相当于阳性药剂宁南霉素;牛尾蒿、土木香、千里光、鱼眼草、天名精、黑蒿、茵陈蒿、全叶马兰、银胶菊、青蒿、细叶山紫苏、荨麻、紫红獐牙菜、女萎、忍冬15种提取物对TMV增殖的抑制活性显著高于宁南霉素;其中香丝草提取物和水麻提取物处理组TMV含量与健康烟叶无差异，表明上述2种提取物能完全抑制TMV在烤烟K326体内的增殖，说明提取物中含有显著抑制病毒增殖的活性物质，值得深入研究。
图2提取物间接ELISA检测结果
H为健康叶片;N为DMSO处理的对照;P为宁南霉素处理的阳性对照。
3、结论与讨论
烟草花叶病毒在农作物上是危害极为严重的侵染性病毒，其寄主范围广、防治难、危害大，给农业上带来极大的经济损失[14]。烟草花叶病毒一般以粒子形式存在，当烟草花叶病毒粒子侵入寄主后，病毒粒子的核酸和寄主的核糖体结合在一起，病毒借助寄主植物的代谢来复制自身蛋白，从寄主获取营养的同时也破坏了寄主组织细胞。当病毒侵入寄主后，与寄主融为一体后，很难做到在不伤害寄主的前提下杀死病毒[15]。植物源抗病毒制剂由于毒副作用小，资源丰富，无残留，高效的优势，在植物病毒病害防治过程中表现出重要的潜在价值[16]。
自1914年Allard首次发现商陆中存在抗病毒活性物质后[17]，有关植物源抗TMV活性物质的研究在逐渐增加，提取到相关的抗TMV活性植物小分子结构有单宁、苦木素、生物碱等[18]。本试验研究了27种植物不同部分提取物的抗烟草花叶病毒活性。抑制作用研究结果表明，其中有8种植物的提取物对TMV侵染烟草具有一定的保护作用，12种植物的提取物具有不同程度的治疗作用，9种植物的提取物具有直接钝化作用，说明不同种类的植物具有不同的抗病毒作用方式。其中抑制TMV侵染活性显著的提取物有马桑、革命菜、荨麻和藿香蓟，其中马桑提取物仅具有良好的保护活性，而后3种植物提取物同时具有钝化和治疗作用。上述几种提取物的抗病毒活性显著，有必要进一步研究其中的抗TMV活性物质。其中革命菜和藿香蓟为入侵植物，危害生态环境，如能开发利用将有效推动它们的综合治理[19]。筛选的27种植物中有一些是没有抑制活性的，其提取物处理组的枯斑数比对照组枯斑数量多，表明这些提取物有利于病毒的侵染，可能含有协同TMV侵染的成分，陈启建等研究有少数植物提取物对TMV侵染有促进作用[20]。
植物病毒为专性寄生，若不能有效识别并侵染寄主，病毒无法复制基因组在寄主细胞内增殖。病毒与寄主间的相互作用在病毒的繁殖和系统侵染中起到至关重要作用[21]。有效的植物抗病毒物质可以直接靶向病毒核酸或蛋白来抑制病毒，或者调节寄主反应(植物激素表达，各种信号转导)来间接抑制病毒，进而影响病毒与寄主间的平衡[22]。
植物提取物中的蛋白质类成分与烟草花叶病毒的病毒外壳蛋白相似，能与病毒争夺寄主上的结合位点;另一类成分(单宁)可以和病毒外壳蛋白结合，形成病毒复合物，病毒外壳蛋白降低对侵染位点的识别能力，使病毒丧失侵染性[23,24]。本研究的植物提取物马桑、革命菜、荨麻和藿香蓟，具有显著的抑制病毒侵染活性，可能提取物中含有大量此类物质，影响了病毒外壳蛋白对寄主侵染位点的识别能力，抑制病毒的侵染。
植物提取物可以断裂、凝聚侵入寄主的病毒粒子，使病毒失去增殖能力[25]。本研究发现，27种提取物中有22种提取物能抑制TMV在烤烟K326中增殖，其中水麻提取物和香丝草提取物的OD405值接近健康叶片对照，说明其抑制TMV增殖的作用效果最强。表明水麻和香丝草对普通烟K326内的病毒增殖具有显著的抑制作用，并且明显高于阳性对照药剂宁南霉素。宁南霉素是目前研究较充分的植物病毒抑制剂，它可以和病毒外壳蛋白相互作用，并抑制TMV病毒粒子的聚合，使病毒不能复制[26]。另一主要作用机制是诱导寄主的防卫反应，诱导寄主防御反应是控制病毒的一种非常有效且对环境安全的方式[27]。病原相关分子模式触发的免疫反应(PTI)是由寄主识别受体(PRRs)感知病毒诱导的重要防御反应[28]。宁南霉素能增强保守的寄主识别受体FLS2和RLK1对病毒的感知，有效激活丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)，转导信号最终激活植物中的各种WRKY转录因子，积极调节PTI途径来有效抑制TMV[29,30]。同时，宁南霉素能增强水杨酸(SA)信号响应相关基因病程相关基因非表达子1(NPR1)的表达，进而促进转录因子WP-KY70表达，作用于SA响应基因。同时转录因子WPKY70的高表达，抑制了茉莉酸(JA)响应基因的表达[30,31]。SA信号转导与JA信号转导同时作用，使寄主产生防御反应，抑制TMV。此外，宁南霉素还参与RNA沉默。其能促进钙调素类似蛋白CML46表达，使CML46与RNA沉默抑制因子RNA依赖性RNA聚合酶RDR1结合并降解，调节RNA沉默相关基因的表达，抑制TMV的复制[30,32,33]。
植物提取物能诱导寄主的病程相关蛋白(PR)，诱导寄主防御反应，提高烟草对TMV的抗性[24];还能增强过氧化氢酶、苯丙氨酸解氨酶、超氧化物歧化酶活性，使清除TMV侵染寄主产生的超氧阴离子自由基和羟基自由基能力增强，进而抑制TMV[24]。另外，植物提取物能干扰病毒外壳蛋白与病毒核酸的装配，影响病毒有效的在寄主体内长距离的传播[24]。水麻、香丝草提取物对TMV增殖的显著抑制活性表明，提取物中可能含有能有效的靶向病毒核酸或蛋白，能诱导烟草病程相关蛋白、调节植物激素表达、PTI途径等活性成分，进而诱导寄主防御反应，抑制TMV的增殖。详细抑制TMV的机理有待进一步研究。本研究以不同植物为研究对象，扩大抗TMV活性物质研究范围，为今后的生物制剂的开发提供一定基础。
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