摘要: 目的 对安肾颗粒主要成分进行定性及定量的质量控制方法研究。 方法 TLC 法鉴别处方中蒲公英、黄柏和玉米须;采用 HPLC 法测定黄柏中盐酸小檗碱的含量,色谱柱为 WondaSil C18 (4. 6 mm伊250 mm, 5 滋m),以乙腈-0. 1% 磷酸溶液 (28 颐 72)为流动相;检测波长 263 nm;流速1. 0 mL/ min;柱温21 益。 结果 TLC 法测定蒲公英、黄柏和玉米须,斑点清晰、分离效果好;HPLC 法测定盐酸小檗碱,进样量在 0. 01441 ~ 0. 08646 滋g 范围内与峰面积呈良好的线性关系,r =0. 9998。 平均加样回收率为 99. 00% ,RSD 为 1. 54 % (n=6)。 结论 本实验方法可做为安肾颗粒的定性定量控制方法。
关键词: 安肾颗粒; TLC 法; HPLC 法
本文源自《解放军预防医学杂志》 CAS 2020年第4期56-59,共4页《解放军预防医学杂志》主要刊载环境卫生和环境监测,劳动卫生与职业健康,饮水卫生,营养与食品卫生,热区、高原、航空、航海等特种环境医学、以及流行医学、微生物学、消毒学、卫生毒理学、放射医学防护学、军事医学心理学等方面的文章。辟有述评、研究论著、卫生标准、文献综述、专题讲座、调查试验、卫生防病经验、实验技术、工作简报等栏目。读者对象为基层卫生防疫人员卫生事业管理人员,以及环境监测、劳动保护等专业技术人员。
原解放军吉林省军区门诊部配制的非标准制剂安肾颗粒,由蒲公英、黄柏和玉米须等药味组成,有补气活血祛湿的功效,主要用于急、慢性肾小球肾炎等症,在临床上疗效良好。 本实验对安肾颗粒的各味主要药材进行了定性定量方法研究,制订后的标准可以更加有效地控制安肾颗粒的质量。
1 材料
1. 1 实验器材 岛津 HPLC( LC - 10A);超声仪 (SB-3200);电子分析天平(CP225D,Sartotius);电子恒温水浴锅(XMTD)。
1. 2 试药 安肾颗粒 ( 原吉林省军区门诊部, 20170610、20170611、20170612);对照品均为中检院出品;试剂:色谱纯乙腈(Mtedia);去离子双蒸水;甲醇 AR、乙醇 AR、乙醚 AR。
2 安肾颗粒主要成分分析过程和结果
2. 1 安肾颗粒的薄层色谱鉴别
2. 1. 1 安肾颗粒中蒲公英测定的薄层色谱鉴别也1-2页 取研磨过的安肾颗粒药粉 5g,混匀,加 5% 甲酸的甲醇溶液 30mL,超声处理 20 分钟,滤过,滤液浓缩至 2 mL,作为蒲公英 TLC 测定的供试品溶液。 精密称取蒲公英对照药材 0. 5 g,加 5% 甲酸的甲醇溶液 20mL,超声处理 20 分钟,滤过,滤液浓缩至 2 mL,作为蒲公英对照药材溶液。 按安肾颗粒的制剂处方,做出不含蒲公英药材的阴性样,精密称取此种阴性样适量,按本法供试品溶液制法操作,制备不含蒲公英药材的阴性液。 照《中国药典》2015 年版 四部 通则 0502 试验,分别将 10 滋L 上述安肾颗粒的三种溶液,在薄层板(硅胶 G) 上点样,用展开剂(乙酸丁酯、甲酸、水组成,比例为 7 颐 2. 5 颐 2. 5) 的上层溶液展开后晾干,在 365 nmUV 灯下检视。安肾颗粒供试品溶液各斑点,应与蒲公英对照药材对应斑点显同样颜色,阴性液无蒲公英药材对应斑点。 (实验条件:T:10益 RH:20% )。 蒲公英 TLC 测定实验结果如图 1。
2. 1. 2 安肾颗粒中黄柏的薄层色谱鉴别
取安肾颗粒药粉 5 g,混匀,加入分析纯甲醇 30 mL,超声仪处理 20 分钟。 使滤液中溶剂挥发完全,只剩余残渣后,加 2 mL 甲醇溶解制成黄柏 TLC 测定的供试品溶液;精密取称黄柏对照药材,加入分析纯甲醇 30 mL,超声仪处理 20 分钟后,使滤液中溶剂挥发完全,只剩余残渣后,加 2 mL 甲醇溶解制成黄柏对照药材溶液;精密取称盐酸小檗碱对照品,置于量程适宜的量瓶内,分析纯甲醇作为溶剂,制成盐酸小檗碱 (0. 05mg·mL-1)对照品溶液。 按安肾颗粒的制剂处方,做出不含黄柏药材的阴性样,精密称取此种阴性样适量,按本法中黄柏 TLC 测定的供试品溶液制法操作,制备不含黄柏药材的阴性液。 照《中国药典》2015 年版 四部 通则 0502 薄层色谱法试验,分别将上述安肾颗粒的四种溶液各 10 滋L,在薄层板 (硅胶 G)上点样,放于浓氨试液预饱和20 分钟的展开缸内,用展开剂(由环己烷、醋酸乙酯、异丙醇、甲醇、水和三乙胺组成,比例为 3 颐 3. 5 颐 1 颐 1. 5 颐 0. 5 颐 1)展开后晾干,在 365 nmUV 灯下检视。 安肾颗粒供试品溶液各荧光斑点,应与黄柏药材及盐酸小檗碱对应位置荧光斑点显同样颜色,阴性液无黄柏及盐酸小檗碱对应荧光斑点。 (实验条件:T:10益 RH:20% )。 实验结果如图 2。
2. 1. 3 安肾颗粒中玉米须的薄层色谱鉴别
取安肾颗粒药粉 5 g,混匀,加入分析纯甲醇 30 mL,超声仪处理 20 分钟。 使滤液中溶剂挥发完全,只剩余残渣后,加 2 mL 甲醇溶解制成玉米须 TLC 测定的供试品溶液;精密取称玉米须对照药材,加入分析纯甲醇 30 mL,超声仪处理 20 分钟后,使滤液中溶剂挥发完全,只剩余残渣后,加 2 mL 甲醇溶解制成玉米须对照药材溶液。 按安肾颗粒的制剂处方,做出不含玉米须药材的阴性样,精密称取此种阴性样适量, 按本法中玉米须 TLC 测定的供试品溶液制法操作, 制备不含玉米须药材的阴性液。 照《 中国药典》 2015 年版 四部 通则 0502 薄层色谱法试验,分别将上述安肾颗粒的三种溶液各 10 滋L,在薄层板(硅胶 G)上点样,用展开剂(由环己烷、醋酸乙酯、甲酸组成,比例为 10 颐 1 颐 0. 1)展开后晾干,在 365 nmUV 灯下检视。 安肾颗粒供试品溶液各荧光斑点,应与玉米须对照药材对应位置荧光斑点显同样颜色,阴性液无黄柏对应荧光斑点。 ( 实验条件: T:10益 RH:20% )。 实验结果如图 3。
2. 2 安肾颗粒中黄柏的指标成分盐酸小檗碱的含量测定也4-5页
2. 2. 1 实验中使用的溶液 把精密称定研细的安肾颗粒 0. 25 g 及 25 mL 甲醇加入锥形瓶中,精密称重, 30 min 超声波处理后冷却,精称,补足至原重量,续滤液作为供试液;精密称取盐酸小檗碱对照品与甲醇, 放置于量程适宜的容量瓶中,配成盐酸小檗碱对照品贮备溶液(含量约50 滋g·mL-1),再取适量用甲醇制成盐酸小檗碱对照品溶液(含量约 5 滋g·mL-1);按安肾颗粒的制剂处方,做出不含黄柏药材的阴性样, 精密称取此种阴性样适量,按前述供试液制法操作, 制备不含黄柏药材的阴性液。
2. 2. 2 HPLC 仪器条件与方法研究 色谱柱 WondaSil (C18,4. 6 mm伊250 mm,5 滋m),色谱柱内温度:21益,以 0. 1%磷酸溶液-乙腈(72 颐 28)为流动相,流动相速度设为1. 0 mL/ min,在波长263 nm 条件下进行测定。 分别取“2. 2. 1冶三种溶液各 10 滋L 进样,结果表明样品中待测成分分离良好,阴性对照无干扰,见图4。
2. 2. 3 考察测定盐酸小檗碱的线性关系 将“2. 2. 1冶盐酸小檗碱对照品贮备溶液稀释成不同浓度的盐酸小檗碱对照品溶液,各精密吸取 10 滋L,依次按 “2. 2. 2冶项条件测定,记录峰面积,以峰面积积分值为纵坐标(Y),进样量(X) 为横坐标,制标准曲线。结果表明,盐酸小檗碱在 0. 01441 ~ 0. 08646 滋g 范围内 线 性 关 系 良 好, 得 回 归 方 程: y = 4 伊 10 6 x + 3609. 1,r = 0. 9998。
2. 2. 4 研究考察重复性及稳定性 取安肾颗粒 (20170611,n = 6),研细,精密称取 0. 25 g / 份,按“2. 2. 1冶实验供试液配制操作后,按“2. 2. 2冶 测定,结果:被测组分盐酸小檗碱平均含量为 0. 6219 mg / g, RSD 为 0. 79 % (n = 6),故此方法重复性较好;另取重复性实验溶液各进样 10 滋L(时间间隔:0 小时、2 小时、4 小时、8 小时、10 小时、12 小时),结果:被测组分的峰面积积分值平均值为 250470. 5,测得峰面积值的 RSD 为 0. 46 % (n = 6),故此种测定方法稳定性比较好。
2. 2. 5 回收率试验 精密称取安肾颗粒(20170611, 盐酸小檗碱含量为 0. 6219 mg / g)0. 4 g、0. 5 g、0. 6 g 三个梯度样品,每个梯度 3 份,分别加入 100 mL 容量瓶中;称取盐酸小檗碱对照品 ( 含量:86. 7% ) 14. 70 mg,置 250 mL 容量瓶中,甲醇定容至刻度,再分别取 4. 0、5. 0、6. 0mL 对照品溶液加入上述已称取安肾颗粒的三个梯度容量瓶中,再分别在三个梯度量瓶中加甲醇 96 mL、95 mL、94 mL,密闭,称重。超声处理 30 分钟,放冷,称重,用甲醇补足减失的重量,取过滤后的续滤液,分别按前述盐酸小檗碱的含量测定实验方法操作、计算(表 1)。
2. 2. 6 测定制剂样品含量 取 3 批安肾颗粒制剂样品(20170610、20170611、20170612),制备、测定方法与上项相同,计算盐酸小檗碱的含量(表 2)。
3 讨论与总结
(1)最大波长的考察。 通过 UV 法对盐酸小檗碱对照品溶液全波长扫描,结果知 263 nm 时灵敏度最高,因此确定为此波长。 (2) 实验中使用的溶液制备的方法确定。 考察溶媒为乙醇、不同浓度甲醇等共四种,考察结果:甲醇作为溶媒时,结果最好,因此确定其为最佳提取溶剂。 实验考察加热回流、超声不同时间,四种处理方法,结果 30 分钟超声所测组分含量明显高于 20 分钟超声和 30 分钟加热回流,故最佳提取方法为用甲醇超声处理 30 分钟。
(3)黄柏为安肾颗粒中主要有效组分,本实验选择其中指标性成分:盐酸小檗碱,确定了其定量测定方法,线性、重复性、稳定性、回收率等定性实验结果表明,选择 HPLC 法作为安肾颗粒中盐酸小檗碱含量的测定方法,操作简便快捷,准确度好,可以作为本品质量控制方法。 (4)中国药典及其他文献资料中均无玉米须薄层定性鉴别,本试验成功将玉米须的薄层鉴别方法纳入标准,方法简便,薄层斑点清晰, 重现性好,为日后研究玉米须的实验人员提供了较好参考价值。 (5) 实验中以乙腈-0. 1% 磷酸溶液 (28 颐 72)为流动相时,柱温控制是关键,本试验柱温超 25益时色谱峰严重拖尾,最终确定柱温为 21益时色谱峰行良好,分离度符合要求。
参考文献:
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