三叶青毛状根的诱导及其液体培养体系的研究

　　摘要： 为建立三叶青毛状根的诱导和液体培养体系，采用发根农杆菌株系C58C1和ATCC15834进行毛状根的诱导，通过无菌三叶青叶片预培养、浸染、共培养、筛选、形态和PCR鉴定等过程获得三叶青毛状根根系，并对三叶青毛状根和两年生块根总黄酮进行比较分析。试验结果表明，发根农杆菌C58C1能从三叶青叶片诱导出毛状根，三叶青毛状根在不添加生长素的1/2MS液体培养基中生长状态良好，其总黄酮含量约是2年生三叶青块根的1/5。

　　关键词： 三叶青; 毛状根; C58C1; 黄酮; 液体培养

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　　三叶青(Tetrastigma hemsleyanum) 是葡萄科崖爬藤属植物，俗名金线吊葫芦、蛇附子、石老鼠等，为我国特有珍稀药用植物，全草可入药，以地下块根最佳[ 1， 2 ]。近些年来，三叶青块根被发现具有低毒和抗癌特性[ 3 - 10 ]，自然资源遭到规模化人为破坏[ 11 - 12 ]。三叶青自然生长条件苛刻，生长缓慢，人工栽培技术还不成熟，难以满足快速增长的市场需求。尽管人们对三叶青进行了微繁和细胞培养研究，但规模化应用明显不足[ 13 - 14 ]。另一方面，人们在三叶青块根中发现了大量的黄酮类物质[ 15 - 19 ]，但一直没有确定其主效成分。毛状根具有生长速度快、遗传稳定、培养周期短、条件可控等优点，可为植物次生代谢产物的规模生产、作物品种改良、环境修复以及相关理论的研究提供快捷的培养体系[ 20 ]。当前，对于三叶青毛状根的研究还较少[ 21 ]，为了解决这些问题，本研究建立了三叶青毛状根的诱导程序，初步建立了其液体培养体系，为三叶青毛状根培养、次生代谢物合成和代谢机理研究奠定了基础，同时希望起到保护三叶青野生资源的作用。

　　1 试验材料

　　三叶青苗(浙江理工大学植物学副教授杨宗岐博士鉴定)由杭州市三叶青农业科技有限公司提供，根据王静等人[ 22 ]的方法获得无菌试管苗。发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)菌株C58C1和ATCC15834由本实验室保存。

　　2 试验方法

　　2. 1 培养基和培养条件

　　采用MS(Murashige and Skoog)培養基[ 23 ]，并进行微调。毛状根诱导体系用培养基：(1)发根农杆菌培养基YEB：牛肉浸膏5 g·L-1、 酵母浸膏1 g·L-1、蛋白胨5 g·L-1、蔗糖30 g·L-1、MgSO4·H2O 0.5 g·L-1，pH：7.0～7.2。(2)叶片浸染液体培养基(ILD)(工作液浓度单位：mg·L-1，下同)：MS+6-BA(6-卞基胺基嘌呤，6-Benzylaminopurine)2+NAA(萘乙酸，1-naph- thylacetic acid)0.5，蔗糖30 g·L-1，pH：5.2～5.4，灭菌后冷至室温，加AS 25。(3)叶片预培养培养基(PCM)：MS+6-BA 2+NAA 0.5，蔗糖30 g·L-1，pH=5.8，植物凝胶2.7 g·L-1。(4)共感染培养基(CID)：MS+6-BA 2+

　　NAA 0.5，蔗糖30 g·L-1，pH：5.2～5.4，植物凝胶2.7 g·L-1，灭菌后加AS 25。(5)除菌培养基(DM)：MS+6-BA 2+NAA 0.5，蔗糖30 g·L-1，pH：5.8～6.0，植物凝胶2.7 g·L-1，特美汀(Timentin，Ti)200，头孢(Cefixime，cef)200。(6)毛状根筛选培养基(SM1)：MS+NAA 0.3，蔗糖30 g·L-1，pH：5.8～6.0，植物凝胶2.7 g·L-1，Ti 200，cef 200。(7)毛状根继代培养基(SCD1)：MS，蔗糖30 g·L-1，pH：5.8～6.0，植物凝胶2.7 g·L-1，Ti 200，cef 200;(8)毛状根继代培养基(SCD2)：MS，蔗糖30 g·L-1，pH：5.8～6.0，植物凝胶2.7 g·L-1。(9)毛状根液体悬浮培养基(LSD)：1/2MS，蔗糖30 g·L-1，pH：5.8～6.0。所有培养基经115 ℃，15 min灭菌，培养基降温至60 ℃以下时添加抗生素和AS。三叶青毛状根诱导培养和固体培养条件为25±2 ℃，暗培养;三叶青毛状根液体培养条件为25 ℃，转速110 r/min，暗培养。

　　2. 2 毛状根诱导

　　用无菌手术刀在三叶青无菌苗叶片表面划出伤口，接种到预培养培养基(PCM)预培养3天。期间，将-80 ℃保存的发根农杆菌ATCC15834和C58C1解冻后，取50 μL加入50 mL YEB液体培养基，摇床培养(28 ℃，220 r·min-1)16～18 h，OD600=0.4～

　　0.6。离心(4 ℃，5500 r·min-1，5 min)，弃上清;用50 mL ILD悬浮菌体，摇床培养(25.5 ℃，150 r·min-1)1～1.5 h后，浸染预培养的三叶青叶片。室温下，将预培养的三叶青叶片放入含有ATCC15834和C58C1菌的ILD浸染液中，浸染5 min。用无菌滤纸吸干叶片表面菌液，转入CID培养基(培养基表面加一层无菌滤纸，用ILD润湿滤纸表面)，共培养3天。然后，用无菌滤纸吸干叶片表面菌液，接入除菌培养基DM中培养7天，再将叶片转入SM培养基中除菌7～10天。不定根长度达0.5～2 cm时，将其切下，接种到SCD1培养基，每15天更换1次继代培养基。继代2次后，将毛状根接种到SCD2培养基，15天更换1次培养基。

　　2. 3 毛状根rol C基因的PCR检测

　　按照植物DNA提取试剂盒(天根，北京)的方法提取三叶青毛状根、无菌苗叶片的DNA。吸取菌液500 μL置于1.5 mL离心管，12 000 r·min-1离心2 min，去清液，加TE液100 μL(TE：10 mmo·L-1 Tris-HCl，1 mmo·L-1 EDTA，pH 8.0)，重悬菌体，沸水煮5 min，12 000 r·min-1离心5 min，取上清于新离心管中，作为PCR检测中的阳性对照。