生长激素从表面意思来说跟我们人体的生长有很大的关系，是由腺垂体分泌的蛋白质，生长激素的分泌还受性别、年龄、昼夜节律的影响，好多增高药的研制，都是从我们的生长激素下手的，下面小编介绍一篇关于生长激素重组的医学论文。
【摘 要】 目的 观察重组人生长激素(recombinant human growth hormone，rhGH)对大鼠脑缺血/再灌注损伤后缺血侧大脑皮质存活素(Survivin)和半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶?3 (Caspase?3)表达的影响。方法 采用大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤模型,将72只健康雄性SD大鼠,随机分为假手术组、对照组和治疗组。分别于模型制作成功后1、3、5、7 d处死大鼠,采用连续切片免疫组织化学技术分别检测缺血侧大脑皮质Survivin 和Caspase?3的表达。结果 治疗组Survivin表达较对照组明显增多,而Caspase?3表达较对照组显著减少。结论 脑缺血/再灌注损伤早期应用rhGH可上调Survivin表达及下调Caspase?3表达,抑制神经元的凋亡。
【关键词】 脑缺血/再灌注损伤;重组人生长激素;Survivin;Caspase?3;细胞凋亡
重组人生长激素(recombinant human growth hormone，rhGH)在1986年通过基因工程技术合成，与人生长激素(human growth hormone, hGH)结构相同，目前主要用于治疗生长激素缺乏性侏儒症、烧伤、抗炎及不育症等。近年来,国内外研究表明,生长激素具有减轻大脑缺血缺氧引起的损伤,抑制细胞凋亡,促进细胞存活等作用[1?4],但机制还不十分清楚。目前,尚未有生长激素对脑缺血/再灌注损伤后Survivin、Caspase?3表达影响的报道。本实验通过应用rhGH观察大鼠脑缺血/再灌注损伤后缺血侧大脑皮质Survivin、Caspase?3表达的变化,探讨其神经保护作用的可能机制,为临床治疗探索新的方法及思路。
1 材料与方法
1.1 实验动物和分组 健康雄性SD大鼠72只,体质量250～280 g,由郑州大学实验动物中心提供。术前禁食12 h,禁水4 h。随机分为假手术组、对照组(脑缺血/再灌注+生理盐水组)、治疗组(脑缺血/再灌注+rhGH组)3组,每组24只。
1.2 主要试剂和药物 重组人生长激素注射液由长春金赛药业有限责任公司生产; Survivin多克隆抗体及Caspase?3多克隆抗体购自美国SANTA CRUZ生物技术公司。
1.3 大鼠脑缺血/再灌注模型的制备及处理 线栓法大鼠局灶性脑缺血/再灌注模型采用改良的Longa[5]线栓法,大脑中动脉(MCA)阻断2 h后,将尼龙栓线拔出,实现再灌注。假手术组除不插线外,其余步骤与对照组和治疗组相同。参照 Zea Longa 5级4分制评分标准[5]，评分为1～3分的实验动物入选。治疗组在脑缺血/再灌注模型成功后开始颈部皮下注射重组人生长激素0.1 U·kg?1· d?1,1次/24 h。对照组注射同样剂量生理盐水,注射时间与次数同治疗组。
1.4 组织切片和免疫组化检测 分别于脑缺血/再灌注后1、3、5、7 d处死大鼠,以4%多聚甲醛灌注固定,石蜡包埋和切片。常规脱蜡、水化,取缺血侧大脑皮质,按试剂盒提供的实验步骤进行操作,DAB显色,光镜下观察,胞浆出现棕色颗粒为阳性着色。
1.5 免疫组化结果分析 在光镜下观察Survivin 和Caspase?3免疫反应的结果,并采用Biosens Digital Imaging System v1.6(上海山富科学仪器有限公司) 图像分析系统进行图像定量分析。Survivin 和Caspase?3免疫组化染色标记强度用灰度值表示,比较各组阳性区平均灰度值的差异。
1.6 统计学处理 所有数据采用SPSS 13.0软件处理,各组数据以±s表示,组间比较采用单因素方差分析,用LSD?t法进行两两比较,检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 大脑皮质Survivin表达的变化 假手术组大鼠脑组织中Survivin仅有少量表达,对照组1～3 d达到高峰,随后逐渐降低,至7 d仍有较高水平的表达,较假手术组显著升高;治疗组较对照组显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。
2.2 大脑皮质Caspase?3表达的变化 Caspase?3在假手术组少量表达,对照组1～3 d达到高峰,后开始下降,至7 d时仍高于假手术组;治疗组较对照组显著下降,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。表1 各组Survivin表达的变化(阳性区平均灰度表示)注：与假手术组同一时间点比较,△P<0.05;与对照组同一时间点比较, ▲P<0.05 表2 各组Caspase?3表达的变化(阳性区平均灰度表示)注：与假手术组同一时间点比较,△P<0.05;与对照组同一时间点比较,▲P<0.05
3 讨论
脑缺血/再灌注损伤是一种常见的、复杂的病理生理过程。有研究表明[6],脑缺血后随着再灌注时间的延长,缺血侧皮层凋亡细胞数量明显增加,主要分布在梗死灶边缘区,48 h凋亡细胞达到高峰,说明凋亡在脑缺血/再灌注损伤中起重要作用。半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶(cysteing aspartate specific protease, Caspase)特别是Caspase?3处于凋亡过程的下游阶段,是凋亡过程中的关键蛋白酶,及时抑制凋亡级联反应过程中的关键蛋白酶,挽救缺血半暗带区尚未凋亡的神经元是脑血管疾病治疗的关键。而Survivin是凋亡抑制蛋白家族的成员,是至今发现作用最强的凋亡抑制蛋白之一,既能抑制细胞凋亡,又能诱导调控神经细胞的有丝分裂及生长周期时相,促进神经细胞增殖和血管生成等[7?8]。
脑缺血/再灌注损伤能促使缺血侧脑组织Survivin强烈持续高表达。我们实验观察到脑缺血/再灌注损伤后Survivin表达升高,1～3 d达到高峰,随后逐渐降低,至7 d仍有较高水平的表达,提示Survivin在脑缺血/再灌注损伤早期即参与抗凋亡的复杂生理过程。应用rhGH干预后Survivin表达显著升高,说明脑缺血/再灌注损伤早期应用rhGH,可以增加Survivin 的合成和分泌。同时发现,脑缺血/再灌注损伤后Caspase?3表达升高,至再灌注1～3 d达到高峰,随后开始下降,至7 d时仍高于假手术组,结果与国内外报道一致,表明脑缺血/再灌注损伤与细胞凋亡存在密切的联系,参与了脑缺血后神经元损伤的病理过程。有研究认为[9?10],生长激素可能通过NF?kappa B 介导的信号转导途径产生抗凋亡蛋白Bcl?2 和BAG?1,促进细胞存活。也有实验发现[2],心肌缺血/再灌注24 h后生长激素组心肌细胞的凋亡以及凋亡相关基因Caspase?3、Cleaved Caspase?3蛋白阳性染色细胞数均明显少于心肌缺血/再灌注组。我们研究发现应用rhGH干预后Caspase?3表达较对照组显著下降,提示rhGH可能直接或间接通过抑制Caspase?3活性,抑制神经元的凋亡。另有研究表明[11],Survivin可能直接抑制Caspase?3和Caspase?7的活性,阻断凋亡信号诱发的细胞凋亡,从而抑制细胞凋亡,发挥脑保护作用。
综上所述,我们认为脑缺血/再灌注损伤早期应用rhGH治疗,可上调Survivin表达，下调Caspase?3表达,抑制神经元凋亡,但其具体的信号转导通道目前尚不清楚,有待进一步研究。
【参考文献】
[1] Azcoitia I, Perez?Martin M, Salazar V, et al. Growth hormone prevents neuronal loss in the aged rat hippocampus[J].Neurobiology of Aging,2005,26(5):697?703.
[2] 黄瑞健，李萌，孙培吾.生长激素对大鼠心肌缺血/再灌注后心肌细胞凋亡及凋亡相关基因Caspase?3 Cleaned caspase?3蛋白表达的影响[J].中国急救医学,2008,28(6):527?530.
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